石 沁，葉利春，劉華僑，張曉存，吳 燈，石召華＊＊

（1.武漢理工大學化學化工與生命科學學院 武漢 430070；2.武漢愛民制藥股份有限公司 鄂州436070；3.湖北省天然組分藥物工程技術研究中心 鄂州 436070）

娑羅子為七葉樹科植物七葉樹Aesculus chinensisBge.、漸江七葉樹AesculuschinensisBge.var.chekiangensis（HuetFang）Fang 或 天 師 栗 Aesculus wilsonii Rehd.的干燥成熟種子。秋季果實成熟時采收，除去果皮，曬干或低溫干燥。為中國藥典收載的中藥[1]。娑羅子主要含有七葉皂苷、脂肪油等成分[2-8]。國內(nèi)外對七葉皂苷的研究報道較多，以婆羅子為原料開發(fā)的藥用制劑主要有七葉皂苷外用凝膠劑、七葉皂苷口服片劑和七葉皂苷鈉注射劑[9]，因此提高娑羅子藥材中七葉皂苷的提取率對于提高生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本、實現(xiàn)綠色生產(chǎn)具有重要意義。

傳統(tǒng)中藥提取方法主要包括水煎煮法、浸漬法、滲漉法、回流法、溶劑提取法等[10]。隨著中藥領域的發(fā)展，傳統(tǒng)中藥提取方法已不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求。罐組分級逆流提取[11]（Multi-stage Countercurrent Extraction，MCCE）是集萃取、重滲漉、動態(tài)和逆流技術為一體的具有多種用途的新型中藥提取工藝。該提取技術具有工藝簡單、效率高、節(jié)省溶劑、能耗低等優(yōu)點,是一種值得推廣的新技術、新工藝。本研究運用“動態(tài)循環(huán)階段連續(xù)逆流提取裝置”，以料液比、乙醇濃度、階段提取時間、提取溫度為考察參數(shù)，優(yōu)化最佳提取工藝參數(shù)，并在最佳工藝參數(shù)下比較罐組分級逆流提取技術和傳統(tǒng)提取技術，為七葉皂苷提取工藝技術改造提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（1260，安捷倫）；分析天平（AB265-S，梅特勒）；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，鞏義市予華儀器有限公司）；臺式低速離心機（TD5A-WS，長沙維爾康湘鷹離心機有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9245A，上海精宏實驗設備有限公司）；超高速多功能粉碎機（SZ-2000B-3，永康市善竹貿(mào)易有限公司）；電子調溫電熱套（98-1-B，天津泰斯特儀器有限公司）。

圖1 對照品色譜圖

圖2 供試品色譜圖

1.2 試藥

七葉皂苷鈉對照品（100346-201703，中國食品藥品檢定研究院）；娑羅子藥材（161203F，武漢愛民制藥股份有限公司）；色譜乙腈（17065093，天地）；分析級乙醇、磷酸（均為國藥集團化學試劑有限公司）；純化水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

2 試驗方法

2.1 七葉皂苷A、七葉皂苷B含量測定

（1）色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗。

以十八烷基鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-0.2%磷酸水（36∶64）流動相，流速為1 mL·min-1；柱溫為30℃，檢測波長為220 nm，進樣量為10 μL。理論塔板數(shù)按七葉皂苷A峰計算不低于5 000，七葉皂苷A、七葉皂苷B峰的分離度不小于1.5。對照品及供試品對應的色譜圖見圖1、圖2。

（2）對照品溶液的制備。

取七葉皂苷鈉對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含有1.5 mg的溶液，即得。

（3）供試品溶液的制備。

取娑羅子粉末1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲提取30 min，放冷，用甲醇補足減失的質量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

（4）線性范圍考察。

取七葉皂苷鈉對照品適量，精密稱定，甲醇溶解配成濃度分別為0.804、0.953、1.214、1.436、1.724 mg·mL-1的混合對照品溶液，分別精密吸取10 μl注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進行檢測。以峰面積（Y）為縱坐標，以質量濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線。七葉皂苷A的線性回歸方程為Y=23412.34X-1923.27，R2=0.9996；七葉皂苷B的線性回歸方程為Y=24139.25X-1309.63，R2=0.9995。表明七葉皂苷A、七葉皂苷B分別在 0.219～0.587 mg·mL-1、0.236～ 0.489 mg·mL-1的范圍內(nèi)線性關系良好。

（5）精密度考察。

取七葉皂苷鈉對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣6次，測定七葉皂苷A、七葉皂苷B的峰面積，計算相應的RSD值分別為0.09%、0.12%，表明儀器精密度良好。

（6）穩(wěn)定性試驗。

取娑羅子供試品溶液，按上述色譜條件分別于0、4、8、16、24、48 h進樣，測定七葉皂苷A、七葉皂苷B的峰面積，計算相應的RSD值分別為1.07%、1.13%。表明樣品在48小時內(nèi)穩(wěn)定。

（7）重復性試驗。

取娑羅子樣品粉末約1.0 g，共6份，精密稱定，依（3）項下分別制備供試品溶液，按上述色譜條件分別進樣，測定七葉皂苷A、七葉皂苷B的峰面積，根據(jù)線性回歸方程計算含量，所得含量相應的RSD值分別為0.84%、0.69%。表明方法具有良好的重現(xiàn)性。

（8）回收率試驗。

取已知含量的娑羅子粉末約1.0 g，共6份，精密稱定，分別精密加入七葉皂苷鈉對照品約75 mg，按（3）項下方法制備供試品溶液，得到6份供試品溶液。按照上述色譜條件進樣，根據(jù)峰面積計算含量，計算平均回收率。七葉皂苷A的平均加樣回收率為99.82%，RSD為0.66%；七葉皂苷B的平均加樣回收率為100.03%，RSD為0.68%。

2.2 出膏率的測定

取娑羅子提取液，濾過，精密量取適量，置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴揮干，于105℃干燥3小時，置干燥器中冷卻1小時，迅速稱重，按下述公式計算出出膏率（W1為蒸發(fā)皿恒重與干膏重之和，W2為蒸發(fā)皿恒重，M為藥材質量，V1為樣品溶液總體積，V2為量取的藥液體積）。

2.3 罐組分級逆流提取工藝[12～15]

（1）罐組分級逆流提取工藝過程。

第1罐的3次提取為梯度形成階段，即提取3次，每次加入新溶媒，得到提取液A1、A2、A3，其中A1儲存。然后開始逆流提取階段，A2作為第2罐第1次提取的溶媒，得B1，儲存；A3作為第2罐第2次提取的溶媒，得B2；B2作為第3罐第1次提取的溶媒，得C1，儲存；依次循環(huán)提取。每罐最后一次提取，均加入純?nèi)苊?。最后合并A1B1C1C2C3得總提液，其過程見圖3所示。測定總提液中七葉皂苷A和B的含量并計算轉移率和出膏率，計算綜合評分。

（2）正交試驗優(yōu)化提取工藝。

在前期預試驗的基礎上，選取料液比、乙醇濃度、階段提取時間、提取溫度為考察因素，以七葉皂苷A+B轉移率、干膏得率為主要考察指標，按L9（34）表進行正交試驗?？疾煲蛩嘏c水平見表1，實驗安排與結果見表2，方差分析結果見表3。

運用正交設計助手Ⅱv3.1設計正交試驗，綜合評價七葉皂苷A+B轉移率和出膏率2個評價指標對提取工藝的影響，其權重按照8∶2分配，計算綜合得分：

綜合得分/%=((Xi/Xmax)×80%+(Yi/Ymax)×20%)×100

其中，Xmax、Ymax分別為正交試驗結果中的七葉皂苷A+B收率和干膏得率的最大值。

由表2、表3可知各因素對綜合評分的影響程度為B乙醇濃度＞A料液比＞C提取時間＞D提取溫度，其中，乙醇濃度和料液比對綜合評分有顯著性影響(P＜0.05)。由極值比較可知，四個因素三個水平之間的趨勢分別為A3＞A2＞A1，B3＞B2＞B1，C1＞C3＞C2，D2＞D3＞D1，故優(yōu)選出的最佳罐組提取工藝為B3A3C1D2，即三罐組條件下藥材粗粉加10倍量70%乙醇以60℃每階段提取20 min。

（3）工藝驗證試驗。

按照優(yōu)選出的最佳提取工藝條件，重復試驗3次，七葉皂苷A+B轉移率和干膏得率結果見表4。由表4可知，3批提取物的綜合評分分別為97.73、99.04、99.31（RSD為0.85%），說明罐組分級逆流提取工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性較好。

圖3 罐組分級逆流提取過程示意圖

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗結果

表3 方差分析結果

（4）與傳統(tǒng)提取方法的比較試驗。取相同量的藥材粗粉，按上述優(yōu)選的罐組分級逆流提取工藝和傳統(tǒng)提取工藝（將藥材粗粉浸泡2 h，過濾，分別加入10-8-8倍量的乙醇回流3次，前1次回流2 h，后2次各回流1 h）進行比較，兩種工藝分別提取3次（n=3），以提取物中七葉皂苷A+B轉移率、干膏得率及特征圖譜為指標，比較兩種提取工藝的優(yōu)劣。

表4 工藝驗證試驗結果

表5 兩種提取方法提取效果比較

表6 兩種提取方法下6批提取物特征圖譜相似度評價

圖4 兩種提取方法下6批提取物的特征圖譜

1）七葉皂苷A+B轉移率和干膏得率 試驗結果見表5。由表5分析可知，與傳統(tǒng)熱回流提取方法相比，采用罐組分級逆流提取法在提高有效成分轉移率和出膏率的同時降低了提取溫度、有效節(jié)省溶劑用量，顯著縮短提取周期，提高了提取效率，降低了后期濃縮能耗，具有較大的成本優(yōu)勢。

2）特征圖譜建立及相似度分析 將兩種提取工藝下的6批供試品溶液按2.1.1項下色譜條件測定并建立HPLC指紋圖譜，見圖4。利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A）”，分析各樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜之間的匹配度及相似性，所得相似度結果見表6，匹配數(shù)據(jù)見表7。

由表6、表7分析可知，6批特征圖譜的相似度均大于0.9，且共有峰個數(shù)均相同，表明兩種提取方法下所得提取物的化學組成及形態(tài)特征高度相似；但是，6批特征圖譜中各共有峰的峰面積有較大差異（除峰3外，其余共有峰的RSD均大于5%，n=6），S1-S3各共有峰的峰面積明顯大于S4-S6中各共有峰的峰面積，表明罐組分級逆流提取對各組分的提取率高于傳統(tǒng)熱回流提取。綜合分析，與傳統(tǒng)熱回流提取方法相比，罐組分級逆流提取法在不改變提取成分的基礎上能明顯提高各個化學成分的提取率。

表7 兩種提取方法下6批提取物特征圖譜匹配數(shù)據(jù)

3 討論

由于使用了罐組分級逆流提取工藝，最大程度提高了乙醇利用率，因而乙醇用量從熱回流工藝的26倍減少到罐組分級逆流提取工藝的18倍，使得生產(chǎn)過程