譚善慧 李彥忠 齊思佳 徐彥浩 段桂運(yùn)

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016)

自2016年以來，寨卡病毒來勢兇猛，危害巨大。世界衛(wèi)生組織聲明，經(jīng)過全世界的調(diào)查研究并確認(rèn)，寨卡病毒就是巴西新生兒的小頭畸形癥的直接元兇[1-3]，該病毒防范困難，傳播方式廣泛[4-6]。寨卡病毒可以通過伊蚊傳播，也可以通過性傳播和母嬰傳播，其中伊蚊傳播為主要傳播方式。能夠傳播寨卡病毒的伊蚊分布在世界各地，因此寨卡病毒可能傳播到更多的國家和地區(qū)[7-8]。目前臨床上更加緊迫的是沒有有效疫苗預(yù)防，也沒有特效藥治療該病毒[9-12]。因此，預(yù)防和治療寨卡病毒已成為世界研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)主要借助計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)軟件對(duì)寨卡病毒的蛋白5RIE與中藥分子庫的化合物進(jìn)行虛擬對(duì)接，試圖找到能夠用于治療寨卡病毒的特效藥。

1 材料與方法

1.1 儀器

HP Z840工作站(美國惠普公司)，聯(lián)想M901HSWY微機(jī)客戶端(中國聯(lián)想集團(tuán)公司)。

1.2 材料

Traditional Chinese Medicine Database(TCMD-21611)數(shù)據(jù)庫，寨卡蛋白5RIE(PDB數(shù)據(jù)庫)；Discovery Studio2017 R2(美國BIOVIA公司)，Libdock——最快的分子對(duì)接技術(shù)，F(xiàn)lexible Docking——全柔性分子對(duì)接技術(shù)、化合物成藥性評(píng)價(jià)(ADMET)等模塊。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

通過對(duì)PDB蛋白庫中寨卡病毒的蛋白進(jìn)行功能分析，最終選定在該病毒復(fù)制階段起重要作用的5IRE蛋白作為靶標(biāo)蛋白，借助計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)軟件DS2017的虛擬篩選技術(shù)，HP Z840工作站，在聯(lián)想M901HSWY微機(jī)上為客戶端進(jìn)行計(jì)算以及中藥活性成分化合物庫(Traditional Chinese Medicine Database)TCMD-21611中的21611個(gè)已知結(jié)構(gòu)的化合物,進(jìn)行初步的虛擬篩選。篩選過程如圖1。

圖1 計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)篩選流程圖

2 結(jié) 果

2.1 Libdock—病毒晶體結(jié)構(gòu)與分子結(jié)構(gòu)處理與準(zhǔn)備

在中藥活性成分化合物庫TCMD-21611中共含21611個(gè)已知結(jié)構(gòu)的化合物,將這些小分子作為配體準(zhǔn)備與5IRE蛋白對(duì)接。

對(duì)接前先將5IRE晶體蛋白去水、加氫，并定義蛋白復(fù)合物所在的位點(diǎn)作為結(jié)合的靶標(biāo)位點(diǎn)；再將21611個(gè)化合物的二維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成三維結(jié)構(gòu)；然后準(zhǔn)備配體；使21611個(gè)已知結(jié)構(gòu)的化合物形成126591不同構(gòu)象的化合物，最后將這些小分子與5IRE蛋白進(jìn)行對(duì)接。

2.2 LibDock-受體-配體的分子剛性對(duì)接

對(duì)21611個(gè)已知結(jié)構(gòu)的化合物形成的126591個(gè)不同構(gòu)象進(jìn)行對(duì)接是一個(gè)很費(fèi)時(shí)間的工作，為此我們采用Discovery Studio 2017中的Libdock—最快的分子對(duì)接技術(shù)將TCMD-21611中的21611個(gè)已知化合物與寨卡病毒的5IRE蛋白分子進(jìn)行剛性對(duì)接，通過分析對(duì)接結(jié)果的打分、氫鍵觀察、熱圖等因素，綜合打分，篩選出分?jǐn)?shù)最高的小分子化合物431個(gè)。小分子與蛋白結(jié)合的二維、三維結(jié)合模式圖如圖2。

圖2 小分子與蛋白二維、三維結(jié)合模式圖

由圖2二維結(jié)構(gòu)可以看出天然化合物分子與蛋白結(jié)合的結(jié)合鍵情況(綠色代表氫鍵，棕色代表范德華力，紫色代表π-陰離子鍵，紅色代表排斥鍵)?？梢郧宄目闯鲂》肿优c受體蛋白的具體氨基酸進(jìn)行了結(jié)合。例如，小分子與ASP161,GLN147,GIY150,ARG164,GIY157形成了很好的氫鍵，與ASP161還形成了π鍵等。從微觀上解釋了分子與蛋白的作用機(jī)制。而通過三維的結(jié)合圖可以看出小分子與蛋白形象結(jié)合，紫紅色囊腔代表蛋白的氨基酸可與小分子的供體官能團(tuán)結(jié)合，綠色代表能與受體官能團(tuán)結(jié)合，從而讓我們知道具有什么樣結(jié)構(gòu)的小分子更加適合于受體蛋白結(jié)合。

2.3 Flexible Docking分子對(duì)接技術(shù)

為了將選出分值較高的配體小分子和受體蛋白精確地對(duì)接，以便得到更精細(xì)的結(jié)果，采用小分子結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換對(duì)接技術(shù)相同的ligand 準(zhǔn)備技術(shù)，對(duì)接前先將化合物的二維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成三維的，然后準(zhǔn)備配體使431個(gè)已知結(jié)構(gòu)的化合物形成32546個(gè)不同構(gòu)象的化合物，最后將這些小分子與5IRE進(jìn)行Flexible Docking。

將篩出的較好化合物再與寨卡病毒蛋白進(jìn)行全柔性對(duì)接，然后也通過它的打分系統(tǒng)、氫鍵、熱圖等結(jié)果進(jìn)行綜合分析，篩選得到活性更高，對(duì)寨卡病毒結(jié)合抑制更好的已知化合物分子，從而做到優(yōu)中選優(yōu)。篩選出活性最高的上述化合物小分子57個(gè)。

2.4 ADMET性質(zhì)預(yù)測

對(duì)57個(gè)天然化合物ADMET性質(zhì)的預(yù)測，通過在25 ℃下水溶解度、血腦屏障通透性、細(xì)胞色素P450 2D6抑制性、肝毒性、人類腸道吸收性和血漿蛋白結(jié)合率六個(gè)方面的具體分析，最終選出5個(gè)ADMET預(yù)測最優(yōu)的天然化合物。ADMET預(yù)測結(jié)果如圖3。

借助計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)軟件DS2017對(duì)篩選的天然化合物進(jìn)行ADMET的預(yù)測，圖3中的粉色環(huán)與紅色環(huán)為血腦屏障通透性的99%、95%的置信區(qū)間模型，淺藍(lán)色環(huán)與綠色環(huán)為人體腸道吸收性的99%、95%置信區(qū)間模型，其他模型的模擬結(jié)果基本與之相似，通過對(duì)比分析，最后選取各模型99%置信區(qū)間內(nèi)的天然化合物，最終得到5個(gè)天然化合物。

圖3 ADMET預(yù)測結(jié)果的2D模式圖

2.5 篩選化合物的結(jié)構(gòu)

最終篩選得到的天然化合物的結(jié)構(gòu)、名稱及打分情況如表1。

表1 最終篩選得到的天然化合物

由表1可以看出，篩選最終確定的這五個(gè)天然化合物中，丹參的虛擬結(jié)果打分最高，說明在丹參含有的該化合物與受體蛋白具有較好的結(jié)合，通過觀察其結(jié)構(gòu)中含有的親水性的羥基與親脂性的酯結(jié)構(gòu)的數(shù)量非常多，在理論上該化合物的水溶性、腸道吸收、化合物的透過性都比較好。

3 結(jié) 論

本研究通過借助計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)軟件使寨卡病毒的5IRE蛋白與天然化合物庫的化合物進(jìn)行模擬對(duì)接并進(jìn)行ADMET預(yù)測，最終篩選出與病毒蛋白結(jié)合較好、打分較高、活性較強(qiáng)的5個(gè)化合物。對(duì)這5個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)在自然界的許多植物皆含有這些成分，而且植物較為常見，從側(cè)面引出天然中草藥可作為預(yù)防和治療寨卡病毒的藥物。

對(duì)篩選結(jié)果進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)多數(shù)化合物有共同的母核與側(cè)鏈，對(duì)這些天然的已知結(jié)構(gòu)的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾改造，設(shè)計(jì)合成并進(jìn)行藥理活性測試，最終得到較好的寨卡病毒抑制劑，從而達(dá)到預(yù)防和治療寨卡病毒目的，并為進(jìn)一步的研究提供充分理論依據(jù)。