盛文文

(皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，安徽 六安 237005)

諸多研究成果表明腫瘤發(fā)生中凋亡抑制發(fā)揮至關(guān)重要的作用，且腫瘤本身便是細(xì)胞凋亡與增殖失衡的結(jié)果。Survivin和Livin是近年來引起關(guān)注的凋亡抑制因子，本研究主要探討Survivin和Livin在乳腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義，從而為誘導(dǎo)乳腺癌凋亡治療的新靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2015年1月—2016年1月56例女性乳腺癌患者手術(shù)切除組織為研究樣本，患者知情同意。病例均為浸潤性導(dǎo)管癌，切除組織標(biāo)本用RNAlater保存液處理，分離出癌旁乳腺組織?；颊吣挲g為26～68歲，中位年齡49歲，術(shù)前均未接受放化療。所有病例均經(jīng)過HE切片驗(yàn)證，根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟的TNM分期依據(jù)，其中0期15例，Ⅰ期12例，Ⅱ期18例，Ⅲ期8例，Ⅳ期3例。

1.2 相關(guān)試劑

Livinm RNA原位雜交試劑盒、濃縮型DAB試劑盒、S-P試劑盒、Livin(1∶50)兔抗人多克隆抗體均購自福州邁新生物公司，Survivin試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 研究方法

RT-PCR檢測(cè)：依據(jù)GenBank中的mRNA序列，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)的研究成果[1-2]，利用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物序列，具體如表2所示。擴(kuò)增40個(gè)周期之后，PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，凝膠中含有0.5 mg/L溴乙錠，利用數(shù)碼相機(jī)在反射紫外燈條件下進(jìn)行光密度掃描分析，通過目的基因?qū)APDH的相對(duì)及光密度值(T/N)進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。

免疫組化：利用SP法，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，通過Livin和Survivin蛋白陽性表達(dá)的染色切片作為陽性對(duì)照。采用半定量計(jì)分法進(jìn)行結(jié)果判定，連續(xù)觀察10組400倍視野后評(píng)價(jià)結(jié)果，腫瘤細(xì)胞按照染色的不同強(qiáng)度劃分為四個(gè)等級(jí)，具體參照文獻(xiàn)[3]。蛋白表達(dá)程度=染色強(qiáng)度計(jì)分×染色百分比計(jì)分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化染色及RT-PCR結(jié)果分析

56例乳腺癌組織中Survivin mRNA和Livin mRNA分別有40例和34例陽性表達(dá)，顯著高于癌旁組織(P<0.05)。免疫組化結(jié)果中，56例乳腺癌樣本中分別有38例和31例染色，癌旁組織中則分別有5例和3例染色，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1，表2。

表2 免疫組化染色及RT-PCR結(jié)果分析[n(%)]

A，Survivin蛋白在乳腺癌中陽性表達(dá)；B，Livin蛋白在乳腺癌中陽性表達(dá)；C，Survivin蛋白在乳腺癌中陰性表達(dá)；D，Survivin蛋白在癌旁組織中陰性表達(dá)

2.2 Survivin和Livin mRNA在乳腺癌組織中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

Survivin mRNA的表達(dá)與患者的年齡、腫瘤大小、TNM分期、雌激素受體、Her2/neu均無關(guān)，僅與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，即在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Livin mRNA表達(dá)則與患者的年齡、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、雌激素受體、Her2/neu均無關(guān)。見表3。

2.3 Survivin和Livin蛋白在乳腺癌組織中的相關(guān)性

38例Survivin陽性表達(dá)組織中，Livin蛋白陽性表達(dá)24例，18例Survivin蛋白陰性表達(dá)組織中，Livin蛋白陽性表達(dá)7例，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Spearman相關(guān)分析表明兩者無顯著相關(guān)(rs=-0.198，P=0.117)。見表4。

表3 Survivin和Livin mRNA在乳腺癌組織中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

表4 Survivin蛋白和Livin蛋白在乳腺癌組織中的相關(guān)性

3 討 論

相關(guān)研究表明[4]，凋亡抑制因子Livin主要通過拮抗死亡受體發(fā)揮作用，并且其凋亡抑制作用強(qiáng)于Survivin。Vucic D的研究發(fā)現(xiàn)Livin基因轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞之后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)TNFR1、Fas、DR4和DR5介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有非常顯著的抑制作用。近年來，有關(guān)Livin基因在乳腺癌組織中表達(dá)的研究成為熱點(diǎn)，但是對(duì)其具體機(jī)制的探討沒有Survivin的研究充分。本研究結(jié)果表明，Survivin和Livin mRNA及蛋白在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率均顯著高于癌旁組織，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與Zhao X[5],Xu W[6]等相關(guān)研究者發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者Survivin和Livin mRNA和蛋白均有過度表達(dá)的結(jié)果一致，表明Survivin和Livin在乳腺癌發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，具有臨床指導(dǎo)價(jià)值。

在凋亡抑制因子的臨床表達(dá)意義上，相關(guān)研究者[7]發(fā)現(xiàn)乳腺癌中Survivin的高表達(dá)與患者預(yù)后具有顯著相關(guān)性，這與本研究結(jié)果中Survivin mRNA在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者與沒有發(fā)生轉(zhuǎn)移患者之間具有顯著差異性的結(jié)論相同。本研究還發(fā)現(xiàn)，Livin mRNA在乳腺癌組織中的表達(dá)與患者的年齡、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、雌激素受體、Her2/neu均無關(guān)。由此可見Survivin和Livin mRNA的表達(dá)均與患者的臨床分期和腫瘤類型無關(guān)。本研究進(jìn)一步分析Survivin和Livin蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種腫瘤細(xì)胞凋亡抑制因子在乳腺癌中的表達(dá)無顯著相關(guān)，考慮與兩種基因具有不同的轉(zhuǎn)錄途徑有關(guān)[8]。

綜上，腫瘤細(xì)胞凋亡抑制因子Livin和Survivin上調(diào)與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，Livin和Survivin可以作為治療乳腺癌的靶基因。