隋 利，易家寧，王康才，薛 啟，梁永富

(南京農業(yè)大學 園藝學院，南京 210095)

隨著人們生活水平的提高，對食品安全的關注度逐漸增加，對蔬菜品質的要求也越來越高，硝酸鹽以及亞硝酸鹽含量的高低被看作是蔬菜質量的一個重要指標。硝酸鹽和亞硝酸鹽主要通過食用蔬菜進入人體[1]，亞硝酸鹽作為一種有毒物質，在人體食用后會在體內與次級胺結合成亞硝胺，從而誘發(fā)各種癌癥[2]。植物中的硝酸鹽和亞硝酸鹽含量受很多因素影響，其中氮肥的不合理施用必然會加劇植物中硝酸鹽的累積。王正銀等[3]研究發(fā)現(xiàn)施氮量與小白菜硝酸鹽累積量之間有顯著關系，并呈現(xiàn)二次回歸關系。姜慧敏等[4]報道，番茄果實的硝酸鹽含量隨氮肥施用量的增加而增加，兩者呈顯著的正相關關系。此外，不同的氮素形態(tài)也影響著蔬菜中硝酸鹽的累積量。硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和酰胺態(tài)氮是植物利用吸收氮素的主要形態(tài)，譚超等[5]發(fā)現(xiàn)施用硫酸銨、硝酸銨以及混合肥料時，幾種蔬菜體內亞硝酸鹽的積累有顯著性差異。有研究表明，適當增施銨態(tài)氮肥可有效降低菠菜莖葉中硝酸鹽和亞硝酸鹽的累積[6]。

紫蘇是中國較為常見的藥食兼用型蔬菜，因其營養(yǎng)成分豐富又可解魚蟹毒，深受大眾的喜愛，但是取食營養(yǎng)器官或貯藏體的葉類蔬菜更容易富集硝酸鹽，研究發(fā)現(xiàn)，人體內攝取的硝酸鹽有70%～85%來自于食用蔬菜[7]，所以如何確保其安全性至關重要。本研究通過施用不同形態(tài)的氮素試驗，觀測紫蘇生長期硝酸鹽和亞硝酸鹽含量以及營養(yǎng)指標的動態(tài)變化特征，尋求其變化規(guī)律，以期控制紫蘇硝酸鹽含量，提高食用紫蘇品質，為紫蘇氮肥的合理施用提供理論與實踐依據。

1 材料和方法

1.1 試驗設計

以產于河北的紫蘇種子為供試材料，經南京農業(yè)大學中藥材科學系王康才教授鑒定為唇形科紫蘇[Perillafrutescens(L.) Britt]。試驗在南京農業(yè)大學校內實驗基地進行，于2017年4月選擇大小一致，長勢相同的紫蘇幼苗進行水培試驗，每盆3株，盆高29 cm × 直徑26 cm，基質為蛭石和珍珠巖按照5∶1比例混合而成?；緺I養(yǎng)液配方中大量元素采用霍格蘭營養(yǎng)液配方，微量元素采用阿農營養(yǎng)液配方，基本營養(yǎng)液 pH 6.0。試驗在總氮量一致(N 濃度為15 mmol/L)的條件下，設計5個不同水平的銨硝態(tài)氮比例(NH4+-N/NO3--N)[100∶0、75∶25、50∶50、25∶75和0∶100]處理及1組酰胺態(tài)氮處理，其中 NH4+-N 由(NH4)2SO4提供，NO3--N由Ca(NO3)2提供，酰胺態(tài)氮由CO(NH2)2供氮。各處理重復6次，并在所有營養(yǎng)液中加入硝化抑制劑二氰胺(DCD) 7 μmol/L。每隔10 d澆1次營養(yǎng)液，每盆每次澆500 mL。

1.2 測定指標及方法

1.2.1葉片硝酸鹽及亞硝酸鹽含量在6、7、8月下旬隨機選擇各處理植株3株，分別采集紫蘇頂部第2-3節(jié)對稱葉片，測定其硝酸鹽和亞硝酸鹽含量。硝酸鹽含量用水楊酸-硫酸法測定；亞硝酸鹽含量用國家標準GB 5009.33-2010的測定標準[8]。

1.2.2葉片可溶性糖和淀粉含量葉片可溶性糖和淀粉含量采用蒽酮比色法測定[9]。

1.2.3葉片游離氨基酸、維生素C和營養(yǎng)元素含量葉片游離氨基酸含量采用茚三酮顯色法測定[9]；維生素C(Vc)含量采用比色法[9]測定；Fe、Mg、Zn、Ca、K、N、Cu含量用ICP-MS法測定。

1.2.4葉片總黃酮含量將采收的紫蘇葉片烘干粉碎，過4號篩，準確稱取0.100 0 g粉末于試管中，加入70 %(體積分數(shù))乙醇10 mL，在一定溫度下超聲處理1 h后過濾，減壓抽濾，所得濾液定容至25 mL，作為待測液。取2 mL濾液于試管中，加入0.5 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，靜置6 min，再加入0.5 mL 100 g/L的硝酸鋁溶液，搖勻并靜置6 min，加入4 mL 40 g/L的氫氧化鈉溶液，最后用70 %乙醇定容至10 mL，搖勻，靜置15 min，在510 nm波長下比色，測定吸光值。以蘆丁為對照品繪制標準曲線。

1.2.5葉片揮發(fā)油含量將陰干后的紫蘇葉片粉碎過20目篩，稱取粉末50 g，置于1 000 mL圓底燒瓶中，按《中國藥典》2015年版方法提取揮發(fā)油5 h，讀取揮發(fā)油體積，加適量無水硫酸鈉對揮發(fā)油進行干燥，求其得油率。

1.2.6葉片迷迭香酸含量參照黃亮輝等[10]的方法進行。將采收的紫蘇葉片烘干粉碎，過4號篩，精確稱取0.5 g 細粉于具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，稱重，超聲45 min，放冷，再稱重，用80%甲醇補足減少的重量，搖勻，濾液用微孔濾膜(0.2 μm)過濾，濾過即得。實驗儀器為 LC-20AT 島津高效液相色譜儀，色譜條件：Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇-1% 磷酸(39∶61)，檢測波長330 nm，流速 1.0 mL/min，柱溫25 ℃。

1.2.7葉片花色苷含量選取1%鹽酸甲醇作為提取液，用電子天平準確稱取1.0 g葉片，剪碎加入5 mL提取液研磨成勻漿，用1%鹽酸甲醇定容至10 mL，離心，上清液供測定用。將上述提取液用紫外可見分光光度計測定530 和657 nm處的吸光度值OD530和OD657。花青苷含量的計算根據Rabino等[11]的方法，公式為A=(OD530-0.25 OD657)/g，式中A為花色苷相對含量(色素單位)。

1.3 數(shù)據處理

試驗數(shù)據采用Excel 2007和SPSS 20.0 軟件進

行統(tǒng)計分析，LSD法檢驗差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 氮素形態(tài)及其配比對紫蘇葉片硝酸鹽和亞硝酸鹽積累的影響

如表1所示，隨著紫蘇的生長，不同氮素形態(tài)及配比處理紫蘇葉片中的硝酸鹽含量均不斷增加。其中，在6和7月份，紫蘇葉片中硝酸鹽含量均隨著硝態(tài)氮比例的增加呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，均在全銨處理(NH4+-N/NO3--N=100∶0)最低，但兩月份分別在NH4+-N/NO3--N為50∶50和25∶75時達到最大值，且顯著高于其余配比和酰胺態(tài)氮(CO(NH2)2)處理(P<0.05)；而在采收期前(8月份)，紫蘇葉片中硝酸鹽含量隨著硝態(tài)氮比例的增加而逐漸增加，在全硝處理(NH4+-N/NO3--N=0∶100)時達到最高，并顯著高于其余配比和酰胺態(tài)氮處理。在整個生育期內，紫蘇葉片硝酸鹽含量在單一氮素形態(tài)處理下均表現(xiàn)為全銨處理顯著最低，而酰胺態(tài)氮處理在6月份顯著最高，全硝處理(NH4+-N/NO3--N=0∶100)在7、8月份顯著最高。

同時，不同的氮素形態(tài)及其配比處理對紫蘇葉片中的亞硝酸鹽含量也影響顯著(表1)。在整個生育期內，紫蘇葉片中亞硝酸鹽含量逐步累積。在6月份，紫蘇葉片中亞硝酸鹽含量在全硝處理下最高(0.36 mg/kg)，在NH4+-N/NO3--N為75∶25時含量最低(0.21 mg/kg)，但與全銨和酰胺態(tài)氮處理無顯著差異；從7月份開始，紫蘇葉片亞硝酸鹽含量均以NH4+-N/NO3--N為50∶50處理最高并與其他處理差異顯著，又均以NH4+-N/NO3--N為25∶75處理最低，并與全銨和酰胺態(tài)氮處理大多差異顯著。在采收前，酰胺態(tài)氮處理和全銨處理的紫蘇葉片亞硝酸鹽含量較低，較最高組(50∶50)分別顯著降低了30.56%、34.72%。

表1 不同氮素形態(tài)及其配比下紫蘇葉片中硝酸鹽積累的變化

注：同列數(shù)據后不同字母表示處理間差異達5%顯著水平。下同

Note ：Values followed by different letters in a column are significant different among treatments at the 5% level．The same as follows

以上結果說明，硝態(tài)氮有助于增強硝酸還原酶活性，促進硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。

2.2 氮素形態(tài)及其配比對紫蘇葉片中可溶性糖、淀粉、游離氨基酸和維生素C含量的影響

由表2可知：紫蘇葉片中可溶性糖和淀粉含量均在全硝處理時達到最大值，全硝處理可溶性糖分別約為全銨處理和酰胺態(tài)氮處理的1.22倍和1.38倍，淀粉含量分別為全銨處理和酰胺態(tài)氮處理的1.09倍和1.14倍，且三者之間存在顯著性差異；紫蘇葉片中可溶性糖和淀粉含量均在銨硝比為50∶50時最低，并與其他處理差異顯著；隨著硝態(tài)氮比例的增加，各硝銨氮配比處理紫蘇葉片中游離氨基酸含量呈現(xiàn)降低的趨勢，在全硝處理下含量最低，用酰胺態(tài)氮處理時，游離氨基酸含量顯著高于所有硝銨氮配比處理，約為全銨和全硝處理的1.05倍和1.84倍。此外，紫蘇葉片中含有豐富的水溶性維生素C(Vc)，其含量在酰胺態(tài)氮處理下最高，其次是全硝處理和銨硝比為50∶50的處理，并且二者差異不顯著，但其在全銨處理下含量最低，且與其余處理差異顯著?？梢姡鯌B(tài)氮更有利于可溶性糖和淀粉的積累，而酰胺態(tài)氮更有利于游離氨基酸和維生素C含量的積累。

2.3 氮素形態(tài)及其配比對紫蘇葉片中礦質元素含量的影響

表3顯示，紫蘇葉片中P和K元素含量表現(xiàn)出一致的變化趨勢，都是在銨硝態(tài)氮比為50∶50時最高，在酰胺態(tài)氮處理時含量最低。除了K元素，紫蘇葉片中Ca元素的含量較高，并且較高的硝態(tài)氮比例更有利于Ca的積累，同時，酰胺態(tài)氮與全硝態(tài)氮處理、銨硝比為25∶75處理以及銨硝比為50∶50處理之間的差異并不顯著。紫蘇葉片中Mg的含量隨著硝態(tài)氮含量的增加大致呈現(xiàn)增加的趨勢，并在全硝態(tài)氮處理下達到最大值(3.91 mg·g-1)，為全銨態(tài)氮處理的1.46倍。此外，相比較而言，紫蘇葉片中Zn、Fe、Mn和Cu元素的含量較低。其中紫蘇葉片中Cu元素含量在各處理間差異并不顯著，而葉中Zn、Fe、Mn元素含量變化規(guī)律大致相同，都是隨著硝態(tài)氮比例的增加出現(xiàn)先降低后升高的趨勢，并且都在全銨態(tài)氮處理下達到最大值。以上結果說明不同礦質元素的累積與氮素形態(tài)有關，并且不同氮素形態(tài)配比Fe、Mn、Zn元素的影響較大。

表2 不同氮素形態(tài)及其配比下紫蘇葉片中可溶性糖、淀粉、游離氨基酸和維生素C含量的變化

表3 不同氮素形態(tài)及其配比下紫蘇葉片中礦質元素含量的變化

表4 不同氮素形態(tài)及其配比下紫蘇葉片中次生代謝產物含量的變化

2.4 氮素形態(tài)及其配比對紫蘇葉片中次生代謝產物的影響

不同氮素形態(tài)及其配比對紫蘇葉片中次生代謝產物總黃酮、揮發(fā)油和迷迭香酸含量的影響也較大(表4)。隨著硝態(tài)氮比例的增加，紫蘇葉片中總黃酮和揮發(fā)油的含量均先升高后降低，并均在NH4+-N/NO3--N為25∶75時達到最大值，且顯著高于酰胺態(tài)氮和其余銨硝氮配比處理，其總黃酮含量分別為全銨態(tài)氮處理、全硝態(tài)氮處理和酰胺態(tài)氮的1.46、1.15和1.09倍，揮發(fā)油含量分別為和全銨態(tài)氮處理、全硝態(tài)氮處理和酰胺態(tài)氮處理的1.29、1.10和1.10倍；全硝態(tài)氮和酰胺態(tài)氮處理間的總黃酮和揮發(fā)油的含量均無顯著差異，但均顯著高于全銨態(tài)氮處理。同時，紫蘇葉片中迷迭香酸含量隨著硝態(tài)氮比例的增加呈現(xiàn)先降低后升高再降低的變化趨勢，同樣在NH4+-N/NO3--N為25∶75處理下顯著高于其他處理，較全銨處理、全硝處理以及酰胺態(tài)處理分別顯著提高了10.89%、33.66%和9.65%，而全銨態(tài)氮處理與酰胺態(tài)氮處理之間無顯著差異。另外，紫蘇葉片中花色苷相對含量以酰胺態(tài)處理最高，其次為NH4+-N/NO3--N為25∶75和全硝態(tài)氮處理的處理，三者間無顯著差異，但三者顯著高于其余處理。以上結果說明NH4+-N/NO3--N為25∶75更有利于紫蘇次生代謝產物的積累。

3 討 論

3.1 氮素形態(tài)及其配比與紫蘇葉片中硝酸鹽、亞硝酸鹽積累的關系

在實際栽培生產中氮肥的不合理施用有可能引起植物硝酸鹽和亞硝酸鹽含量超標。對于綠葉蔬菜，其安全性評價主要集中在硝酸鹽和亞硝酸鹽的積累以及農藥殘留上。根據世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧農組織的規(guī)定，硝酸鹽、亞硝酸鹽的日允許攝入量分別為3.6 mg/(kg·d-1)和0.13 mg/(kg·d-1)。本實驗中紫蘇葉片硝酸鹽和亞硝酸鹽含量最高分別為5.11 mg/kg和0.72 mg/kg，遠遠低于432 mg/kg和15.6 mg/kg(按平均體重60 kg，日食蔬菜鮮重0.5 kg計算)[12]。說明合理的施用氮肥并不會引起硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的超標，但在實際生產中還需科學施肥，盡量降低植物體內的硝酸鹽和亞硝酸鹽的積累。

侯迷紅等[13]通過對白菜、油麥菜和生菜的研究發(fā)現(xiàn)，隨著硝銨比的減小，各蔬菜的硝酸鹽含量逐漸減少，并在全硝態(tài)氮處理下達到最大值。許自成等[14]也發(fā)現(xiàn)隨著硝態(tài)氮比例的增加，鮮煙葉中硝酸鹽含量不斷上升。同時，氮肥與有機肥配合能夠降低黃瓜硝酸鹽含量，交互作用極顯著[15]。本研究結果表明：不同的氮素形態(tài)及其配比對紫蘇葉片硝酸鹽和亞硝酸鹽含量影響顯著。隨著栽培時間的增加，葉片硝酸鹽含量隨硝態(tài)氮含量的增加而不斷累積，在采收前(8月份)全銨態(tài)氮處理的硝酸鹽含量最低；而8月份時亞硝酸鹽含量在NH4+-N/NO3--N為25∶75時最低。說明施用硝態(tài)氮會增加植物硝酸鹽的積累，可能是因為底物濃度高而導致硝酸鹽含量增加。也有研究表明銨態(tài)氮可以抑制根系對硝態(tài)氮的吸收，從而來降低硝酸鹽的積累[16]。適當比例的銨硝配施有利于降低紫蘇葉片亞硝酸鹽含量，可能是因為硝態(tài)氮誘導了硝酸還原酶活性增強，使硝酸鹽轉化為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽被亞硝酸還原酶還原為銨根離子，一定程度上抑制了硝酸根的還原。同時蔬菜中的硝酸鹽和亞硝酸鹽含量還受施肥時間和收獲時間的影響，一般葉類蔬菜硝酸鹽含量的高峰期在施肥后10 d左右出現(xiàn)[17]。在實際生產中，對紫蘇的追肥應該避開采收期進行，以減少其亞硝酸鹽的累積。

3.2 氮素形態(tài)及其配比與紫蘇葉片營養(yǎng)品質的關系

紫蘇作為一種藥用芳香蔬菜，營養(yǎng)豐富。蔬菜的營養(yǎng)品質指標有纖維素、維生素、氨基酸、糖、蛋白質以及礦質元素等因子。其中維生素C作為人體內必需的營養(yǎng)物質，人體不能合成，而需要從食物中攝取。本試驗發(fā)現(xiàn)，酰胺氮態(tài)處理下紫蘇葉片維生素C含量最高，其次是全硝處理和銨硝比為50∶50處理。說明施用硝態(tài)氮和酰胺態(tài)氮更有利于維生素C的形成，這與楊月英等[18]在番茄上的研究結果相似。不同氮素形態(tài)對紫蘇葉片的可溶性糖含量、淀粉含量以及游離氨基酸含量也影響顯著。紫蘇葉片可溶性糖和淀粉含量隨著供硝比例的升高而呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，并在全硝處理下達到最大值。說明硝態(tài)氮處理更有利于可溶性糖和淀粉的積累，可能是因為硝態(tài)氮有利于碳水化合物的合成、分解代謝和運輸，對植物光合碳同化的促進作用大于銨態(tài)氮[19]。另外，紫蘇葉片中游離氨基酸含量在酰胺態(tài)氮處理下最高，可能是由于不同氮素形態(tài)在作物體內代謝途徑差異較大造成的。

張富倉等[20]發(fā)現(xiàn)適宜的氮素形態(tài)和比例，不僅能夠促進白菜生長和品質的提高，還能增加其對水分和養(yǎng)分的吸收和利用，硝態(tài)氮的吸收有利于促進陽離子的吸收。本研究結果表明：紫蘇葉片中Fe、Mg、Ca和Cu含量都在全硝處理下最高，K、P和Ca含量在銨硝比為50∶50時最高。發(fā)生這種現(xiàn)象的原因可能是因為一方面植物吸收硝態(tài)氮和銨態(tài)氮后，根系pH發(fā)生變化，影響其對礦質元素的吸收，進而影響其含量；另一方面銨根離子可能與陽離子有競爭作用。其機理還有待進一步探討。在中國人體中，鈣是缺失最嚴重的營養(yǎng)元素之一，不足營養(yǎng)協(xié)

會推薦的日攝入量的50%，本研究發(fā)現(xiàn)紫蘇葉片中Ca含量豐富，可以作為補鈣蔬菜進行推廣。同時，本次試驗中紫蘇葉片礦質元素含量均符合國家標準。

3.3 氮素形態(tài)及其配比與紫蘇葉片次生代謝產物含量的關系

紫蘇葉片中總黃酮、揮發(fā)油、迷迭香酸和花色苷都是其次生代謝產物，同時也是主要的藥用成分。氮素是影響植物生長和次生代謝的主要外界因素。不同的氮素形態(tài)可能通過影響植物體內的C/N代謝，進而影響其次生代謝產物的含量。本研究中紫蘇葉片總黃酮含量隨銨硝比的增加而呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這可能是因為銨態(tài)氮有利于可溶性糖等光合產物的積累，而黃酮類化合物在植物體內合成代謝的起初源就為光合產物[21]。但花色苷作為一種類黃酮化合物，是由花色素與糖結合而生成的，這可能也是紫蘇葉片花色苷與可溶性糖含量都在NH4+-N/NO3--N為50∶50時最低的原因。紫蘇葉片中揮發(fā)油含量變化趨勢與其總黃酮含量變化趨勢相似，這與蘇蕓蕓等[22]在藿香上的研究結果一致。于曼曼等[23]發(fā)現(xiàn)夏枯草果穗中的迷迭香酸含量隨銨態(tài)氮比例的降低而先減小后增加，在NH4+-N/NO3--N為25∶75時含量最高，本實驗結果也與之相同。無論是外界刺激或植物本身，都可能因其生境改變而不同程度地刺激或抑制自身次生代謝物的形成。

綜上所述，不同氮素形態(tài)及配比對紫蘇葉片的硝酸鹽積累、營養(yǎng)成分以及主要化學成分的含量均有不同程度的影響。適當?shù)牡匦螒B(tài)及配比較單一的氮素形態(tài)更有利于降低其亞硝酸鹽含量，并且NH4+-N/NO3--N為25∶75的處理能有效提高葉片中總黃酮、揮發(fā)油以及迷迭香酸的含量，可以將其作為藥用植物的施用指標。而酰胺態(tài)氮可以提高紫蘇葉片維生素C和游離氨基酸的含量，可以將其作為葉類蔬菜的施用指標。