官紀元，樊衛(wèi)國*

(1 貴州大學 農學院，貴陽550025；2 貴州省果樹工程技術研究中心，貴陽550025)

刺梨(RosaroxburghiiTratt.)是原產中國西南地區(qū)的特色果樹，目前在貴州喀斯特地區(qū)石灰性土壤上的種植規(guī)模日益擴大。石灰性土壤中有效磷含量極低[1-2]，因此，刺梨面臨嚴重的磷養(yǎng)分脅迫問題。研究不同供磷水平對刺梨苗生長和養(yǎng)分含量及相關生理指標的影響，對于了解刺梨適應低磷脅迫的機制和栽培中磷養(yǎng)分的調控都具有重要的科學意義。

植物對磷的需求和對低磷脅迫的適應機制存在差異，合理的施磷量可以促進植物生長，供磷過多或過少對生長都會產生抑制[3-7]。對低磷脅迫適應能力強的植物，能夠通過根系的總面積、平均直徑、側根及根毛數量和長度的增加或排根的形成增大根系與土壤的接觸面積，從而增強對土壤中磷的截獲[6-11]。在生理上，能夠通過體內酸性磷酸酶(APase)和根系分泌性酸性磷酸酶(SAPase)活性的增強、根系小分子有機酸和SAPase分泌量的增加適應低磷脅迫，APase活性的增強能夠促進植物體內有機磷轉化為無機磷供植物循環(huán)利用[12-14]，分泌到根際中的小分子有機酸和SAPase能夠促進根際土壤中難溶性磷的活化，提高磷的有效性，進而促進植物對磷的吸收[15]。不同植物根系分泌的小分子有機酸種類、含量及功能具有差異性[15-18]，然而在根中有機酸的合成是其向根外分泌的重要物質基礎。磷對植物吸收其他營養(yǎng)元素有重要的影響，在煙草(Nicotianatabacum)[19]、大豆(Glycinemax)[20]、豇豆(Vignaunguiculata)[21]、巴西橡膠(Heveabrasiliensis)[22]等植物上的研究發(fā)現(xiàn)，當適當提高供磷水平后，這些植物對氮素的吸收量增加，這一相助作用與磷能夠促進根系中硝酸還原酶(NR)活性增強密切相關[23]。過低或過高的供磷水平都會導致植物體內養(yǎng)分失衡，施磷過量會抑制植物對鐵、鋅及銅等元素的吸收[2]，在低磷脅迫下柑橘(Citrusreticulata)葉片中氮、磷、鉀、鈣、鎂、錳、硼等元素的含量明顯減少[4]。

迄今，僅發(fā)現(xiàn)刺梨對缺磷脅迫的反應十分敏感[24]，有關低磷脅迫對刺梨生長、根系形態(tài)、養(yǎng)分吸收及相關生理特性的影響尚不了解，刺梨適應低磷脅迫的機制更不清楚。為此，本試驗采用石英砂和蛭石混合基質培養(yǎng)的方法，研究了不同供磷水平對‘貴農5號’刺梨實生苗的生長、根系形態(tài)特征、根和葉中APase、NR以及根中SAPase的活性、根中小分子有機酸組分及含量和植株中營養(yǎng)元素含量的影響，旨在為揭示刺梨適應低磷脅迫的機制和喀斯特地區(qū)刺梨栽培的磷養(yǎng)分管理提供科學的理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于2016年和2017年在貴州省果樹工程技術研究中心進行。試材為‘貴農5號’刺梨實生苗。用于試材幼苗培育的種子從‘貴農5號’刺梨品種的1個單株上采集，采種單株在開花期用透氣透光無紡布棚罩進行異花授粉隔離，以獲得自花授粉的種子，盡量降低試材幼苗個體間遺傳差異的影響。培養(yǎng)基質由2∶1的蛭石和石英砂混合而成，事先用0.3 %的HCl溶液浸泡7 d后反復用蒸餾水沖洗后備用。培養(yǎng)容器為口徑30 cm、高45 cm的塑料桶。營養(yǎng)液配制所用化合物為分析純，水用去離子水。測定根中有機酸組分及含量的所用的標準品為色譜純，購自Sigma公司。

1.2 材料的培養(yǎng)與處理

試驗設7個不同供磷水平處理，各處理營養(yǎng)液中有效磷(P2O5)含量分別為5、25、45、65、85、105及125 mg·L-1。每個處理3桶，重復4次，每桶植苗10株。每年3月10日將層積處理后的‘貴農5號’刺梨種子在蛭石基質苗床上播種育苗，待幼苗長到2葉1心時移栽在培養(yǎng)基質中，然后澆去離子水適應1周，再澆1/2濃度的不同處理營養(yǎng)液適應1周后進行不同供磷水平處理培養(yǎng)。試驗培養(yǎng)的營養(yǎng)液選用Hongland和Arnon配方[25]作為基本配方，根據刺梨偏好硝態(tài)氮的營養(yǎng)特性[26]，將營養(yǎng)液中的氮用NO3--N和NH4+-N提供，硝銨比為3∶1。營養(yǎng)液中除磷的濃度不同外，其他營養(yǎng)元素的濃度均與Hongland及Arnon營養(yǎng)液配方一致。用0.1 mol·L-1的NaOH和H2SO4將營養(yǎng)液pH值調整到6.0。營養(yǎng)液中加入7 μmol·L-1硝化抑制劑二氫胺，以防止NH4+的硝化后改變營養(yǎng)液中NO3--N和NH4+-N的比例。培養(yǎng)處理期間每隔7 d澆營養(yǎng)液1次，每次澆營養(yǎng)液前用pH6.0的去離子水對培養(yǎng)基質進行冗余灌澆，避免磷在基質中富集改變其濃度，然后再用不同處理的營養(yǎng)液進行冗余澆灌，讓多余的營養(yǎng)液從培養(yǎng)容器底部排水孔溢出，避免基質中營養(yǎng)液濃度被稀釋。材料培養(yǎng)至第60天時取樣測定以下各項指標。

1.3 取樣和指標測定

1.3.1生長和根系形態(tài)指標在分別測定不同處理下植株株高和基徑后，然后小心翻盆取出刺梨苗，每個處理取12株(4次重復，每個重復3株)測定整株及地上部、根系的鮮質量，將植株用去離子水洗凈后，在105 ℃下殺酶10 min，置于55 ℃下烘干至恒重，測定整株、地上部及根系的干質量，并計算根冠比。另外，在每個處理的4次重復中各取1株用Epson Perfection 4990 Photo根系掃描儀和圖像分析軟件WinRHIZO (Express 1000XL1.0版)對根系總長度、平均直徑、總表面積、總體積及總根尖數進行測定和分析。

將不同處理的培養(yǎng)基質用水輕輕的淋洗，小心取出完整無損傷的根系，從上取不同處理的根冠之后0～3 cm根毛區(qū)的生長根，在Olympus BX-63數字顯微鏡下觀察、測定和記錄根毛的長度及單位長度上的數量，計算根毛的平均長度和根毛密度，根毛密度以1 cm長度的生長根根段上的根毛數表示。

1.3.2酸性磷酸酶和硝酸還原酶活性取每個處理的植株中部葉片和生長根各0.2 g，采用Bacber法[27]測定葉片和根中的APase活性；采用Mclanchlan法[28]測定根系的SAPase活性；采用離體法[29]測定葉片和根中NR的活性。每個處理的同一生理指標取樣4份進行4次重復測定。

1.3.3根系中有機酸種類和含量稱取不同處理的生長根各4份，每份1.5 g，剪碎置于研缽中，加入3 mL蒸餾水和少許石英砂將根系研磨成勻漿，移入10 mL離心管，再用1 mL蒸餾水洗滌研缽2次并轉移至離心管，滴入3滴百里酚以抑制微生物活動，液體總體積為5 mL。于45 ℃水浴中提取15 min，轉速20 000 r·min-1離心20 min，上清液過0.45 μm濾膜后再用HPLC進行4次重復測定。

色譜條件: Wondasil C18型色譜柱，柱溫30 ℃，流動相A為0.022 mol·L-1KH2PO4溶液(pH 2.2)，流動相B為甲醇(色譜純)，進樣量為20 μL，紫外檢測波長為210 nm，上機測定的洗脫模式為等濃度洗脫，總流速0.7 mL·min-1，流動相B濃度3.0%。

有機酸標樣的標準曲線繪制：先配制10 mg·mL-1的草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸標準儲備液和1 mg·mL-1的乙酸標準儲備液，分別按照草酸與酒石酸1∶5的體積比以及草酸與其他4種有機酸1∶10的體積比吸取各有機酸標準儲備液，根據實驗需要配制出不同濃度的混合標準液。以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪標準曲線。

1.3.4整株礦質元素含量將烘干的刺梨苗整株研磨粉碎，過篩，每個處理都分別準確稱取4份樣品各0.5 g，用于測定N、P、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn及B的含量，每個元素均進行4次重復測定。N含量測定用凱氏定氮法，P含量測定用釩鉬黃比色法，K含量測定用火焰光度計法，Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn含量測定用原子吸收分光光度計法，B含量測定用姜黃素比色法[30]。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

利用DPS V7.05統(tǒng)計軟件進行顯著性和相關性分析，多重比較采用Duncan’s新復極差法。文中數據均為2年2次試驗結果的平均值。

2 結果與分析

2.1 不同磷水平對刺梨苗生長及根系形態(tài)特征的影響

研究結果表明，適宜的供磷水平可以促進刺梨苗的生長，過低或過高的供磷水平都會對刺梨苗的生長產生抑制。圖1和表1顯示，刺梨苗在不同磷水平處理間的生長差異明顯。其中，在45 mg·L-1供磷水平下，刺梨苗的長勢最好，株高、基徑和生物量都最大；隨供磷水平的增加或降低，刺梨苗的生長受到明顯抑制，植株的高度、基徑和生物量隨之減?。辉诟哂?5 mg·L-1磷水平的3個處理中，植株的生長指標比5 mg·L-1低磷水平處理的還要小，說明供磷水平過高對刺梨苗生長的抑制比低磷脅迫更加嚴重。同時，表1還顯示，刺梨苗根冠比在5 mg·L-1供磷水平下最大，當增大供磷水平后表現(xiàn)出明顯減小的趨勢。

從表2可看出，在45 mg·L-1的供磷水平下，刺梨苗根的總長度、總表面積、總體積、平均直徑和總根尖數都最大，并與其他供磷水平處理的差異都達到顯著水平(P<0.05)，降低或提高供磷水平后上述指標都顯著下降。然而, 根毛長度及密度的變化在不同供磷水平的處理中卻有所不同，其中，根毛的長度和密度在5 mg·L-1低磷水平下達到最大，隨供磷水平的提高根毛的長度和密度明顯下降。5 mg·L-1低磷水平的根毛長度和密度分別是125 mg·L-1高磷水平的4倍以上和7倍以上?？梢?，低磷水平下根毛長度和密度的增大可能是刺梨苗應對低磷脅迫所采取的適應策略，這對于刺梨增強磷的吸收和緩解低磷脅迫對自身的不利影響具有重要作用。17:01 2018/9/5

圖1 不同磷水平下刺梨苗生長狀態(tài)Fig.1 Growth status of Rosa roxburghii seedlings under different supply levels of phosphorus

供磷水平Levels of P/(mg·L-1)株高Plant height/cm基徑Base diameter/cm生物量Biomass/(g·plant-1)地上部Shoot根系Root整株Plant根冠比值Root-shoot ratio514.47±0.55e0.24±0.02d0.26±0.01e0.23±0.01e0.49±0.02e0.88±0.02a2522.50±0.50c0.35±0.01c0.70±0.04c0.43±0.01c1.13±0.04c0.61±0.04c4533.70±0.36a0.46±0.01a2.44±0.06a0.99±0.04a3.43±0.09a0.41±0.30g6525.13±0.80b0.39±0.01b1.20±0.06b0.56±0.03b1.76±0.07b0.47±0.01f8515.67±0.42d0.22±0.02d0.50±0.02d0.26±0.02d0.76±0.03d0.52±0.02e10510.13±0.61f0.20±0.01e0.31±0.01e0.18±0.01f0.48±0.02e0.58±0.02d1257.33±0.42g0.17±0.01f0.19±0.01f0.12±0.01g0.31±0.01f0.63±0.02b

注：在同一列中不同的小寫字母表示0.05水平顯著差異。下同

Note: Different normal letters in same column mean significant difference at 0.05 level. The same as below.

表2 不同磷水平下刺梨苗根系形態(tài)特征的變化

表3 不同磷水平下刺梨苗葉片和根中的APase、NR和SAPase的活性

2.2 不同磷水平對刺梨苗葉片、根系中APase及NR和SAPase活性的影響

表3顯示，在5 mg·L-1供磷水平下，刺梨苗葉片和根中的APase及根中SAPase的活性達到最強，顯著高于其他供磷水平；隨供磷水平的進一步提高，葉片及根中的APase和根中SAPase的活性明顯減弱，且處理間的差異都達到顯著水平(P<0.05)，說明低磷脅迫會誘導刺梨苗葉片及根中APase和根中SAPase的活性增強，這也是刺梨應對低磷脅迫所采取的重要生理適應策略。同時，刺梨苗葉片和根中的NR活性以45 mg·L-1供磷水平的處理為最強，降低或提高供磷水平后NR的活性均明顯減弱(表3)。因此，供磷水平過低或過高都可能會對刺梨氮的吸收與同化產生不利的影響。

2.3 不同磷水平對刺梨苗根中小分子有機酸種類及含量的影響

本試驗結果表明，從不同磷水平處理的刺梨苗根中檢測到草酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、乙酸和琥珀酸等6種小分子有機酸(表4)。其中，在5 mg·L-1磷水平處理的刺梨苗根中，上述6種小分子有機酸的含量均達到最高，而隨供磷水平的提高，根中6種小分子有機酸及其總含量隨之降低，說明低磷脅迫具有誘導刺梨苗根中小分子有機酸合成的作用，這一生理響應與刺梨苗遭受低磷脅迫后根系對外分泌有機酸可能具有重要的聯(lián)系。

2.4 不同磷水平對刺梨苗中營養(yǎng)元素含量的影響

在不同磷水平下刺梨苗中各種營養(yǎng)元素的含量具有明顯的差異性。表5顯示，對于刺梨苗中N、K、Fe、Mn、Cu、B元素，其含量以45 mg·L-1磷水平處理的為最高，降低或提高供磷水平后上述元素都明顯減少；當供磷水平提高到85 mg·L-1以上后，上述元素含量的減少更加明顯。同時，刺梨苗中P、Ca和Mg的含量隨供磷水平的增大而增加，Zn的含量則隨供磷水平的增大而降低。另外，刺梨苗中K和Fe的含量在45和65 mg·L-1兩個磷水平處理間的差異不顯著，刺梨苗中B的含量在25和45 mg·L-1供磷水平處理之間也沒有顯著差異，其他供磷水平處理間刺梨苗中N、P、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn及B的含量差異均達到顯著水平(P<0.05)。以上結果說明：供磷過多對刺梨吸收N、K、Fe、Mn、Cu、B、Zn元素有更加不利的影響，但對其吸收P、Ca和Mg元素有明顯促進作用。

3 討 論

植物應對低磷脅迫會表現(xiàn)出根系形態(tài)變化、磷酸酶活性增強和根系分泌物增加等適應機制，在不同植物上以上適應機制具有差異性[15]。根冠比增大是植物應對低磷脅迫的反應之一，在低磷脅迫下植物通過根系的增大以增強對磷的吸收，通過地上部生長的減弱以降低對磷的消耗，這種適應性反應還與較多的磷向根系分配有關[31]。在低磷水平下，刺梨苗根冠比明顯增大，類似的結果在很多植物上都有報道[4,9,32-33]。植物還能夠通過根系形態(tài)的變化適應低磷脅迫，通常表現(xiàn)出根的表面積、側根和根毛的長度及數量的增加，以此增加根系與土壤的接觸面積，增強對磷的截獲能力[11]。根毛對養(yǎng)分吸收有重要的作用，它可使根的表面積增加1～10倍以上[34]。在本研究中，在5 mg·L-1的低磷水平下刺梨苗根的總長度、總表面積、總體積和總根尖數雖然沒有增加，但根毛長度和密度的卻成倍的增加了，這對增強根系對養(yǎng)分的吸收具有極其重要的促進作用，這也是刺梨苗應對低磷脅迫采取的重要適應策略。

同時，在不同供磷水平條件下，刺梨苗根和葉中的Apase和根中的SAPase活性變化是協(xié)同一致的，均表現(xiàn)為隨供磷水平的降低而增強，低磷脅迫下Apase和SAPase的活性達到最強，這是因為APase是一個誘導酶，植物獲得低磷脅迫信號后會誘導體內Apase基因的表達，促進Apase的合成并且增強其活性，從而促進體內有機磷轉化為無機磷供生長循環(huán)利用[35-37]。因此，低磷脅迫下刺梨根和葉中Apase活性的增強對緩解自身因供磷不足造成的不利影響有積極的作用。在低磷條件下刺梨苗根中SAPase的活性增強，意味著刺梨根系會增大磷酸酶的分泌量，從而會促進根際環(huán)境中有機磷的分解，改善有效磷的供給。低磷脅迫下刺梨苗葉片及根中APase和根中SAPase的活性增強，實際上是刺梨苗應對低磷脅迫采取的重要生理適應策略。

植物的根和葉分別是NO3-還原的主要場所[32]。低磷脅迫會降低刺梨苗根、葉中的NR活性，因此對氮的吸收與代謝具有不利的影響。NR是限速酶，植物吸收的NO3-進入細胞后，可以誘導NR的產生，增強其活性[38]，從而促進NO3-還原成NH3及以后的氮同化過程[39]。磷是NADPH的組成元素, NADP+/NADPH作為NR的電子載體, 可將電子從FAD轉移到NO3-上, 使其還原為NO2-，最終還原成NH3[40]，因此，可以肯定缺磷對刺梨苗氮的吸收與同化有抑制作用，這一作用與低磷脅迫引起刺梨苗體內缺磷導致NR活性減弱有關。以往的研究已證實，刺梨具有偏好吸收NO3--N的特性[41]，供磷水平過低、過高都會降低刺梨對NO3--N的吸收[42]。本試驗供氮的硝銨比為3∶1，在45 mg·L-1磷水平下刺梨苗中氮含量最高，意味著NO3-的吸收量也會相應的增大，從而會誘導刺梨葉和根中NR活性的增強。供磷過低或過高后，刺梨苗中NR的活性會隨NO3-的吸收量減少而減弱。

在缺磷環(huán)境中，植物的根系會增加小分子有機酸分泌量，從而通過有機酸的酸溶、螯溶和解吸附作用提高土壤中磷的有效含量[43-46]，在本研究中，低磷脅迫下刺梨根中6種小分子有機酸的含量都明顯提高了，說明低磷脅迫能夠誘導刺梨根中小分子有機酸的合成，這一結果會增加刺梨根系向根外分泌小分子有機酸的物質基礎，這也是刺梨適應低磷脅迫的重要生理表征。

果樹在吸收P的過程中對其他營養(yǎng)元素的吸收具有相助或拮抗的作用，其中P與Zn是具有拮抗作用，施P和吸收P過多會降低Zn的吸收[47]。在柑橘[4]和鐵核桃(Juglanssigillata)[9]上，低磷脅迫或供磷過多會使N、K、Fe、Zn、B等營養(yǎng)元素的含量或吸收量降低。在本研究中，在供磷水平達到45 mg·L-1時，刺梨苗的生物量最大，N、K、Fe、Mn、Cu、B的含量最高，說明適宜的供磷水平有利于刺梨苗的生長和對上述營養(yǎng)元素的吸收，降低或增加供磷水平對上述營養(yǎng)元素的吸收會產生不利的影響，類似的結果在油茶(Camelliaoleifera)[48]、扁桃(Amygdaluscommunis)[49]、梨栆(Zizyphusjujuba)[50]等樹種上都有報道。刺梨苗中Ca和Mg的含量隨著供磷水平的提高而增大，這可能與P與Ca、Mg元素之間吸收的相助作用有關[2,51]，這在柑橘[4]、鐵核桃[9]等樹種上也有類似報道。

綜上所述，供磷水平過高或過低均會降低刺梨苗的生物量、根的總長度、總表面積、總體積、平均直徑和總根尖數，這是刺梨苗的生長受到抑制的結果。刺梨苗具有應對低磷脅迫的適應策略，在低磷條件下刺梨苗的根冠比值、根毛長度和密度的增大，根和葉片中的APase及根中SAPase的活性明顯增強，根中的小分子有機酸含量的明顯增加，是其適應策略的重要表征。適宜供磷水平有利于刺梨苗對各種營養(yǎng)元素的吸收，在45 mg·L-1供磷條件下，刺梨苗中的N、P、K、Mn、Cu、B含量明顯提高，進一步降低或提高供磷水平后對刺梨苗中上述元素的含量有降低作用。低磷脅迫下導致刺梨苗中N含量降低與缺磷引起NR的活性減弱有關。刺梨苗中P、Ca和Mg的含量隨供磷水平的提高而增大，Zn的含量隨供磷水平的增大而減小。今后應深入研究低磷脅迫誘導刺梨根毛發(fā)生變化的機理和Apase活性增強的分子機制，揭示刺梨根系中小分子有機酸的合成與分泌對適應低磷脅迫的作用，同時要通過栽培試驗進一步探究土壤中有效磷含量多少對刺梨生長和果實產品及品質的影響，為深入解析刺梨適應低磷脅迫的機理和生產上的磷養(yǎng)分管理提供科學依據。