吳英青，馮 陽(yáng)，唐 容，龍麗蓉，歐庸彬

(西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽(yáng) 621010)

硼元素是植物必需的微量元素之一，對(duì)植物正常生長(zhǎng)和農(nóng)作物產(chǎn)量有著重要作用[1]。但是，適合植物生長(zhǎng)發(fā)育的土壤有效硼濃度范圍非常狹窄，一般認(rèn)為是0.5～1.0 mg/kg，因此經(jīng)常出現(xiàn)缺硼和硼中毒的現(xiàn)象[2]。由于土壤形成母質(zhì)及干旱、半干旱地區(qū)降水稀少、蒸發(fā)量大等原因，世界范圍內(nèi)很多地區(qū)土壤有效硼含量較高[3]。中國(guó)西部和北方地區(qū)土壤有效硼含量較高，西藏阿里地區(qū)鹽堿土有效硼濃度高達(dá)23 mg/kg[4]。另一方面，人類(lèi)活動(dòng)也可能導(dǎo)致土壤有效硼的積累，中國(guó)涉硼企業(yè)面積大、分布廣，硼的總排放量較大，遼寧寬甸硼礦開(kāi)采區(qū)的土壤全量硼含量高達(dá)1 195 mg/kg[5]。

植物硼中毒的一般癥狀，先是葉尖或葉緣褪綠，接著出現(xiàn)黃褐色的壞死斑，擴(kuò)展到側(cè)脈，進(jìn)而向中脈延伸，最終導(dǎo)致葉片壞死或呈枯萎狀，并過(guò)早脫落[6]。另外，植物根系對(duì)高硼脅迫比較敏感，根尖分生組織活性被抑制，細(xì)胞分裂速度減緩，根長(zhǎng)變短[7]。在高硼條件下，植物受到活性氧傷害，輸導(dǎo)組織被破壞，木質(zhì)素和木栓質(zhì)在植物體內(nèi)累積，進(jìn)而影響組織分生，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)停滯[8]。

楊樹(shù)對(duì)高硼脅迫具有很強(qiáng)的耐性，是硼超累積植物。當(dāng)土壤有效硼濃度為40 mg/kg時(shí)，雜交楊葉片積累的硼濃度高達(dá)1 200 mg/kg，是同一條件下其他物種的20倍[9]。研究表明，某些雜交楊能耐受的土壤有效硼濃度達(dá)到93 mg/kg，且其生物量與對(duì)照相比沒(méi)有降低[10]?？紤]到楊樹(shù)生長(zhǎng)迅速，生物量大，根系發(fā)達(dá)，適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，可以利用楊樹(shù)對(duì)富硼土壤和硼污染進(jìn)行生物修復(fù)。目前，該方法已被成功應(yīng)用于造紙廠所排放富硼廢棄物的修復(fù)[11]。最近的研究顯示，來(lái)自于楊柳科的8個(gè)樹(shù)種中，黑楊(P.nigra)最適合用于修復(fù)濕地生態(tài)系統(tǒng)的硼污染[12]。我們課題組的前期研究分析了土培盆栽楊樹(shù)對(duì)長(zhǎng)時(shí)間(2個(gè)月)硼脅迫處理的生理響應(yīng)特征，發(fā)現(xiàn)分布在中國(guó)西北部的新疆楊(P.bolleca, 銀白楊變種)和俄羅斯楊(P.russkii, 歐洲黑楊雜交種)均對(duì)硼脅迫具有較高的耐性[13]。本研究進(jìn)一步采用水培試驗(yàn)，分析俄羅斯楊對(duì)短期(7 d)硼脅迫的生理響應(yīng)特征，為進(jìn)一步研究楊樹(shù)的高硼耐性機(jī)理和利用俄羅斯楊修復(fù)硼污染提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料培養(yǎng)

本研究采用俄羅斯楊(Populusrusskii)作為實(shí)驗(yàn)材料。為了避免不同單株之間的差異，減小實(shí)驗(yàn)誤差，實(shí)驗(yàn)材料取自同一棵生長(zhǎng)于西南科技大學(xué)溫室旁的樹(shù)齡為3年的俄羅斯楊。實(shí)驗(yàn)從2017年7月29日開(kāi)始進(jìn)行。剪取直徑約為1 cm的枝條，去除葉片，剪成長(zhǎng)約10 cm的插穗，約150枝。將插穗下端2 cm浸在自來(lái)水中，遮光，生根5 d，每天換水。挑選生根良好的插穗，置于1/2 Hoagland溶液中水培，每周更換營(yíng)養(yǎng)液。水培4周后，挑選生長(zhǎng)情況較一致的植株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。水培和后續(xù)處理均在西南科技大學(xué)溫室中完成，采用自然光照，水簾降溫。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

調(diào)查顯示，涉硼工業(yè)區(qū)土壤和水體硼濃度均較高，遼寧寬甸的地下水平均硼濃度為1.7 mmol/L，涉硼企業(yè)所排放污水的平均硼濃度為13.0 mmol/L[14]。因此，本試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)硼濃度處理，采用1/2 Hoagland溶液加入硼酸配制而成，即CK(1/2 Hoag-land溶液，硼酸濃度為0.05 mmol/L)、BS1(1/2 Hoagland溶液+1 mmol/L硼酸)、BS5(1/2 Hoag-land溶液+5 mmol/L硼酸)、BS10(1/2 Hoagland溶液+10 mmol/L硼酸)。每種濃度處理18株，分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)。處理7 d后，先測(cè)定植物葉片凈光合速率和葉綠素?zé)晒鈪?shù)；然后取第5～10葉位的成熟葉片，用錫箔紙包裝，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存，并在2周內(nèi)進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

葉片凈光合速率(Pn)采用Li-6400便攜式光合作用測(cè)定系統(tǒng)(Li-Cor, Lincoln, NE, USA)測(cè)量，葉綠素?zé)晒鈪?shù)PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)換效率(Fv/Fm)采用M-PEA植物光合效率分析儀(Hansatech Instruments Ltd., UK)測(cè)定。測(cè)定時(shí)，選擇植株第4葉位的葉片在天氣晴朗的上午9: 00～11: 00進(jìn)行活體測(cè)定。

其他生理指標(biāo)采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。先將樣品在液氮中充分研磨，取約0.2 g粉末至2 mL或10 mL離心管(分析天平稱(chēng)重，液氮預(yù)冷)，分析天平稱(chēng)出總重，并計(jì)算出樣品凈重。然后參照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定以下指標(biāo)：光合色素含量(貨號(hào)：CPL-2-G)、過(guò)氧化氫含量(H2O2-2-Y)、丙二醛含量(MDA-2-Y)、超氧化物歧化酶活性(SOD-2-Y)、過(guò)氧化物酶活性(POD-2-Y)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性(APX-2-W)、抗壞血酸含量(ASA-2A-W)、脯氨酸含量(PRO-2-Y)、可溶性糖含量(KT-2-Y)和可溶性蛋白質(zhì)含量(KMSP-2-W)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2013軟件處理并作圖，用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析及差異顯著性檢驗(yàn)(Tukey’s test,P< 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 硼脅迫對(duì)俄羅斯楊水培苗生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

俄羅斯楊水培苗在硼脅迫處理7 d后的生長(zhǎng)狀態(tài)如圖1所示。其中， BS1處理水培苗根系和葉片均未見(jiàn)硼毒害癥狀，且葉片比對(duì)照更為鮮綠； BS5處理水培苗葉片褪綠變黃，但幼嫩莖和根系與對(duì)照無(wú)明顯差異； BS10處理水培苗葉片嚴(yán)重變黃，成熟葉片表現(xiàn)尤為明顯，幼葉輕微卷曲，幼嫩莖節(jié)間伸長(zhǎng)明顯受到抑制，根系長(zhǎng)度變短，顏色略顯黃色，根尖數(shù)量變少?？梢?jiàn)，俄羅斯楊水培苗在1 mmol/L硼酸處理下生長(zhǎng)得到促進(jìn)，在5 mmol/L硼酸處理下呈現(xiàn)輕微脅迫癥狀，而在10 mmol/L硼酸處理下表現(xiàn)出嚴(yán)重毒害癥狀。

2.2 硼脅迫對(duì)俄羅斯楊水培苗凈光合速率和PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)換效率的影響

隨著硼酸濃度的增加，俄羅斯楊葉片凈光合速率(Pn)呈先升高后下降的變化趨勢(shì)，并在BS1處理時(shí)達(dá)到最高；BS1處理葉片Pn是對(duì)照(CK)的1.358倍，且與對(duì)照差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，而B(niǎo)S5和BS10處理的Pn與對(duì)照無(wú)顯著差異(圖2，A)。同時(shí)，俄羅斯楊葉片PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)換效率(Fv/Fm)在BS1和BS5處理下與對(duì)照無(wú)顯著差異，而在BS10處理下比對(duì)照顯著下降(圖2，B)。以上結(jié)果表明，適合俄羅斯楊水培苗生長(zhǎng)的最佳硼濃度可能在1 mmol/L左右，遠(yuǎn)高于1/2 Hoagland溶液中的硼濃度(0.05 mmol/L)；但當(dāng)硼濃度為10 mmol/L時(shí)，幼苗的光合作用受到明顯的抑制。

2.3 硼脅迫對(duì)俄羅斯楊水培苗葉片光合色素含量和比例的影響

隨著硼濃度的增加，俄羅斯楊水培苗葉片葉綠素a、葉綠素b和類(lèi)胡蘿卜素含量均表現(xiàn)出先升后降的變化趨勢(shì)，并均在BS1處理達(dá)到最大值，且BS1處理均顯著高于對(duì)照，而B(niǎo)S10處理均與對(duì)照無(wú)顯著差異(圖 3，A～C)。同時(shí)，水培苗葉片葉綠素a與葉綠素b的比值(Chla/Chlb)隨著硼濃度的增加呈逐漸降低的趨勢(shì)，且BS1處理與對(duì)照無(wú)顯著差異，而B(niǎo)S5和BS10處理均比對(duì)照顯著下降(圖3，D)。以上結(jié)果顯示，俄羅斯楊捕獲的光量子在光反應(yīng)中的利用效率下降，可能導(dǎo)致活性氧生成量增加。

CK、BS1、BS5和BS10處理培養(yǎng)液中的硼酸濃度分別為0.05、1、5和10 mmol/L。下同圖1 硼脅迫下俄羅斯楊水培苗生長(zhǎng)狀態(tài)的變化The boric acid concentrations in the culture solution of CK, BS1, BS5 and BS10 treatments were 0.05, 1, 5, and 10 mmol/L, respectively. The same as belowFig.1 The growth situation of hydroponic Populus russkii seedling under boron stress

2.4 硼脅迫對(duì)俄羅斯楊水培苗葉片過(guò)氧化氫和丙二醛含量的影響

俄羅斯楊水培苗葉片過(guò)氧化氫(H2O2)含量在4種硼濃度處理下均沒(méi)有顯著變化(圖4，A)；其丙

2.5 硼脅迫對(duì)俄羅斯楊水培苗葉片抗氧化酶活性及抗壞血酸含量的影響

俄羅斯楊水培苗葉片SOD和APX活性隨著硼脅迫濃度的升高均呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，且各硼脅迫處理均顯著高于對(duì)照；兩種酶活性分別在BS5和BS1處理下達(dá)到最大值，分別是相應(yīng)對(duì)照的1.374倍和19.076倍(圖5，A、B)。同時(shí)，水培苗葉片POD活性在BS1和BS5處理下與對(duì)照相近，而在BS10處理下比對(duì)照顯著上升，達(dá)到對(duì)照的1.250倍(圖5，C)。另外，俄羅斯楊水培苗葉片抗壞血酸含量在各濃度硼脅迫處理下均不同程度上調(diào)，其中BS1和BS10處理的增幅達(dá)到顯著水平，分別是對(duì)照的1.983和2.492倍(圖5，D)。

數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n = 3；不同小寫(xiě)字母表示處理間在0.05水平存在顯著性差異(Tukey’s test)。下同圖2 硼脅迫下俄羅斯楊水培苗凈光合速率(Pn)和PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)換效率(Fv/Fm)的變化Data shown are mean ± SD (n = 3). Different normal letters indicate statistical significance among different treatments at the 0.05 level according to Tukey’s test. The same as belowFig.2 The Pn and Fv/Fm in leaves of hydroponic P. russkii seedling under boron stress

圖3 硼脅迫下俄羅斯楊水培苗葉片光合色素含量和比例的變化Fig.3 The contents and ratio of photosynthetic pigments in leaves of hydroponic P. russkii seedling under boron stress

2.6 硼脅迫對(duì)俄羅斯楊水培苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

隨著硼酸濃度的增加，俄羅斯楊水培苗游離脯氨酸和可溶性糖含量呈上升趨勢(shì)，但僅在BS10處理下與對(duì)照差異顯著，此時(shí)分別是對(duì)照的3.369倍和1.255倍(圖6，A、B)；同時(shí)，各處理水培苗可溶性蛋白含量與對(duì)照相比均無(wú)顯著差異(圖6，C)。

圖4 硼脅迫下俄羅斯楊水培苗葉片過(guò)氧化氫和丙二醛含量的變化Fig.4 The contents of H2O2 and MDA in leaves hydroponic P. russkii seedling under boron stress

圖5 硼脅迫下俄羅斯楊水培苗葉片抗氧化酶活性和抗壞血酸含量的變化Fig.5 The activities of antioxidant enzymes and the content of ascorbic acid in leaves of hydroponic P. russkii seedling under boron stress

圖6 硼脅迫下俄羅斯楊水培苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化Fig.6 The contents of osmoprotectants in leaves of hydroponic P. russkii seedling under boron stress

3 討 論

本本研究顯示，當(dāng)硼酸濃度為1 mmol/L時(shí)，俄羅斯楊葉片與對(duì)照相比更為鮮綠，葉片光合色素含量和Pn增加，而Fv/Fm、H2O2和MDA含量與對(duì)照無(wú)顯著差異。當(dāng)硼酸濃度為5 mmol/L時(shí)，葉片褪綠變黃，Chla/Chlb比值下降，但其他參數(shù)，特別是Pn和MDA含量，與對(duì)照無(wú)顯著差異。當(dāng)硼酸濃度為10 mmol/L時(shí)，植株的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重的抑制，Chla/Chlb和Fv/Fm顯著下降，MDA含量顯著上升。結(jié)果表明，俄羅斯楊的生長(zhǎng)情況在添加1 mmol/L硼酸時(shí)優(yōu)于1/2 Hoagland溶液，在添加5 mmol/L硼酸時(shí)受到輕微硼脅迫，在添加10 mmol/L硼酸時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重硼毒害癥狀。與其他常見(jiàn)物種如擬南芥[7]、小麥[15]、水稻[16]、蘋(píng)果[8]、柑橘[17]等的相關(guān)研究相比，本研究采用的硼酸濃度較高，而毒害癥狀主要在10 mmol/L硼酸處理時(shí)出現(xiàn)，表明俄羅斯楊具有較強(qiáng)的硼毒耐性。

等活性氧有關(guān)。

AsA是植物細(xì)胞中重要的非酶抗氧化劑，在保護(hù)葉綠體免于氧化損傷中起著重要的作用[23]。本研究中，俄羅斯楊葉片AsA含量在硼處理?xiàng)l件下顯著增加，在一定程度上反映了其抗逆性；但是，在10 mmol/L高硼條件，AsA含量的上調(diào)還可能與APX活性的下調(diào)(相比于1 mmol/L和5 mmol/L)有關(guān)，即AsA分解量減小。另外，本研究中游離脯氨酸和可溶性糖含量在10 mmol/L硼處理時(shí)顯著上調(diào)。脯氨酸也具有非酶抗氧化劑的功能，同時(shí)參與植物細(xì)胞的滲透勢(shì)調(diào)節(jié)[21]。植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)作用是植物適應(yīng)脅迫環(huán)境、增強(qiáng)抗逆性的基礎(chǔ)。

綜上所述，俄羅斯楊水培苗在低濃度硼溶液中能正常生長(zhǎng)，甚至優(yōu)于對(duì)照；在中等硼濃度脅迫條件下，其葉片SOD和APX活性顯著上調(diào)，有助于清除活性氧，免于其遭受膜脂過(guò)氧化傷害，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐硼性；但在有效硼濃度過(guò)高的情況下，葉片褪綠變黃、莖尖和根尖生長(zhǎng)受抑制，F(xiàn)v/Fm下降，Chla/Chlb比值下降，MDA含量上升；同時(shí)其POD活性、游離脯氨酸和可溶性糖含量上調(diào)，仍有助于減少高硼脅迫造成的損傷。