李培謙，馮寶珍

(運城學院，山西 運城 044000)

灰霉菌(Botrytiscinerea)能夠引起大田作物，水果蔬菜及園林花卉等1000多種植物的病害，在農業(yè)生產上造成嚴重的經濟損失[1]。當前，灰霉病的防治是以化學防治為主。但是灰霉菌適應性強，繁殖快，易突變，很快對多種藥劑產生抗藥性，如：多菌靈、腐霉利、乙霉威等[2～3]。

啶酰菌胺屬于琥珀酸脫氫酶抑制劑 (succinate dehydrogenase inhibitors) 類殺菌劑，由德國巴斯夫公司開發(fā)，可用于防治灰霉病菌核病銹病白粉病等[4]。自2006年開始在我國登記用于防治蔬菜灰霉病[5]。其作為新穎吡啶類殺菌劑，具有活性高、作用機理獨特、殺菌譜較廣、不易產生交互抗性、對作物安全等特點。然而，隨著該藥劑的推廣使用，已有報道顯示在部分地區(qū)有些作物上出現(xiàn)了抗性。余玲等[6]報道山西部分地市保護地蔬菜對啶酰菌胺產生了抗藥性。石延霞等[3]發(fā)現(xiàn)我國主要蔬菜種植區(qū)的灰葡萄孢的抗性頻率高達41%以上，并且高抗菌株占62%以上。這都表明灰葡萄孢對啶酰菌胺的抗性發(fā)展迅速，需要加強田間用藥指導，規(guī)范合理用藥。

植物病原菌出現(xiàn)抗藥性，其生理生化特性也會發(fā)生改變。新型殺菌劑SYP-1620引起灰葡萄孢抗性菌株菌絲生長速率減慢，致病力下降但是沒有引起菌絲干重變化[7]。氟啶胺引起灰葡萄孢呼吸速率下降及ATP酶活性升高等方面生理特征改變[8]。目前關于見關于番茄灰霉菌抗啶酰菌胺菌株生理生化特性方面的報道尚少，而該特性對探明菌株的抗藥性機理及進行抗性風險評估具有重要意義。本研究以番茄灰霉菌敏感菌株和抗性菌株為研究對象，比較分析這兩種類型菌株在苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)、適應性評價及致病力等生理生化特性差異，以期為闡明病原菌的的抗藥性機制提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試60個番茄灰霉菌株于2012-2016采于山東濰坊、泰安、濟南，河南三門峽以及山西運城等地的番茄種植保護地。采用單孢分離法獲得菌株，在PDA斜面培養(yǎng)5～7天，然后置于4 ℃冰箱保存。敏感性菌株采自未使用過啶酰菌胺的番茄植株。

1.2 供試藥劑

試驗所用啶酰菌胺(boscalid)水分散粒劑(96%)，由上海源葉生物科技有限公司提供。96%丙酮(分析純)，由萊陽市康德化工有限公司生產。

1.3 番茄灰霉菌抗性水平測定

參照前人研究，利用菌絲生長速率法測定番茄灰霉菌對啶酰菌胺的敏感性[9]。

1.3.1 含藥培養(yǎng)基制備

稱取濃度為96%的啶酰菌胺原藥166.67 mg，溶解于5 mL的丙酮溶液中，再加入少量乳化劑(吐溫80)，使其溶解更充分，最終制得濃度為32 g·L-1的啶酰菌胺母液。在無菌操作臺上，用移液槍取一定量的啶酰菌胺藥液于含有50 mL PDA培養(yǎng)基的錐形瓶中，再用移液槍吸打，使其與培養(yǎng)基充分混勻，乘熱，倒入培養(yǎng)皿中，制備含藥培養(yǎng)基。按上述方法，制備含藥培養(yǎng)基終濃度分別為0(CK)、5、10、20、30 μg·mL-1。

1.3.2 抗性水平測定

然后將直徑5 mm菌餅接種于上述培養(yǎng)基內，而后置于22 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5天左右，等到培養(yǎng)皿內菌絲生長到大約培養(yǎng)皿大小的四分之三時，測量其菌落直徑。利用十字交叉法分別測量每個培養(yǎng)皿中的菌落直徑，如果遇到橢圓形的或者形狀不規(guī)則的要分別測量它們的最短直徑和最長的直徑，然后分別求其平均值，利用DPS軟件分別求其菌絲生長抑制率及試驗菌株的EC50值。啶酰菌胺抗藥性水平標準參照Veloukas等[10]的方法。

1.4 酶活性分析

1.4.1 菌絲制備

選取抗性菌株R1和敏感菌株S1進行PAL和POD酶活性分析。先將這兩個菌株在PDA培養(yǎng)基上于22 ℃黑暗培養(yǎng)3 d，于菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅。分別接入含有質量濃度為1.0、5.0、25.0μg·mL-1的啶酰菌胺的PDA液體培養(yǎng)基中，每瓶接入20塊菌餅，然后于22 ℃恒溫、120 r·min-1下分別振蕩培養(yǎng)。并于0、1.5、6和24 h取樣。菌絲體經四層紗布過濾，再用無菌水沖洗3次，吸水紙吸干水分后，放在-80 ℃?zhèn)溆?。?.1 μg·mL-1丙酮溶劑稀釋液為對照，每個處理重復3次。

1.4.2 PAL活性分析

稱取1 g樣品，液氮研磨后轉移至2 mL 離心管，加入無菌水制備粗酶液。參照前人研究方法[11]，分別配制反應液：pH 8.7硼酸緩沖液和0.02 mol·L-1的L-苯丙氨酸溶液。試管中分別加入2.0 mL硼酸緩沖液、1 mL L-苯丙氨酸以及0.5 mL粗酶液，然后置于40 ℃水浴中反應60 min，后用0.5 mL 6 mol·L-1的鹽酸終止反應。對照用0.5 mL硼酸緩沖液代替粗酶液。用紫外分光光度計測定290 nm處吸光度A290的變化。以每1 min內A290變化0.01為1個酶活力單位(μmol·min-1)，實驗重復3次。

1.4.3 POD活性分析

根據(jù)付麗等[12]的研究方法采用愈創(chuàng)木酚法，并略加改進。反應體系為: pH 5.8磷酸緩沖液2.0 mL，3% H2O21 mL，0.05 mol·L-11 mL、粗酶液1.0 mL。37 ℃水浴，反應15 min后迅速轉入冰浴中，對照以磷酸緩沖液代替酶液。用紫外分光光度計在470 nm處測定反應3 min時的吸光度(A)。每隔30 s記錄1次，共記6次，以每1 min內A470變化0.01為1個酶活力單位(μmol·min-1)，實驗重復3次。

1.5 適應性評價

1.5.1 菌絲生長速率測定

采用生長速率法對抗性菌株與敏感性菌株的生長情況進行了比較[13]。取直徑5 mm的菌餅接種到PDA培養(yǎng)基上于22 ℃黑暗培養(yǎng)3 d，然后十字交叉法測定菌落直徑大小。每個菌株做四個平板，試驗重復兩次。

1.5.2 產孢量測定

取直徑5 mm的菌餅接種到PDA培養(yǎng)基上于22 ℃黑暗培養(yǎng)12 d，然后加入5 mL無菌水，兩層紗布過濾后得到分生孢子懸浮液。然后在顯微鏡下計數(shù)，檢測孢子數(shù)量。

1.5.3 菌株干重測定

根據(jù)liu 等[13]的方法對抗性菌株與敏感性菌株干重進行了測定。取10塊直徑5 mm的菌餅接種到250 Ml 三角瓶PDA液體培養(yǎng)基中，然后于22 ℃恒溫、120 r·min-1下分別振蕩培養(yǎng)3天。菌絲體經四層紗布過濾，再用無菌水沖洗3次，吸水紙吸干水分后，放在烘箱內80 ℃處理8 h，然后稱重。每個菌株培養(yǎng)3瓶，實驗重復2次。

1.6 致病性測定

將直徑5 mm的菌餅接種番茄果實，于22 ℃黑暗培養(yǎng)，分別在第1、3、5 d測量病斑大小。每個菌株接種3個健康番茄果實，試驗重復2次。

2 結果與分析

2.1 啶酰菌胺抗性菌株與敏感性菌株PAL活性比較

圖1為抗性菌株R1和敏感性菌株S1在不同濃度(1、5、25 μg·mL-1)啶酰菌胺處理后體內PAL酶活性測定結果。在處理后24 h內，兩菌株PAL活性變化趨勢基本一致，均呈現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，并且隨著藥物濃度增高酶活性也相應升高。兩菌株均在處理后1.5 h時PAL酶活性達到鋒值，而后逐漸降低。很明顯在各處理濃度下，抗性菌株R1的PAL活性均高于敏感菌株S1。當啶酰菌胺濃度25 μg·mL-1時，抗性菌株R1 PAL酶活達到118.75 μmol·min-1，為同條件下敏感性菌株S1 PAL(76.29 μmol·min-1)的1.56倍。

圖1 不同濃度啶酰菌胺處理后抗性菌株和敏感性菌株體內PAL活性分析Fig.1 Analysis of PAL activity in the resistant strain and the sensitive strain after treatment with different concentration of Boscalida: 0 μg·mL-1; b: 1 μg·mL-1; c: 5 μg·mL-1; d: 25 μg·mL-1; R表示抗性菌株，S表示敏感性菌株a: 0 μg·mL-1; b: 1 μg·mL-1; c: 5 μg·mL-1; d: 25 μg·mL-1; R：resistant isolate R1，S: sensitive isolate S1

2.2 啶酰菌胺抗性菌株與敏感性菌株POD活性比較

不同濃度啶酰菌胺處理后，抗性菌株R1和敏感性菌株S1體內過氧化物酶(POD)的酶活力變化如圖2所示。兩菌株POD活力變化趨勢基本一致，在24 h內酶活性不斷升高，并且在24 h達到峰值。在各處理條件下，R1體內POD活力明顯高于S1。在處理后24 h，抗性菌株酶活力增幅明顯大于敏感性菌株。

圖2 不同濃度啶酰菌胺處理后抗性菌株和敏感性菌株體內POD酶活性分析Fig.2 Analysis of activity of POD enzyme in the resistant strain and the sensitive strain after treatment with different concentration of Boscalida: 0 μg·mL-1; b: 1 μg·mL-1; c: 5 μg·mL-1; d: 25 μg·mL-1; R表示抗性菌株，S表示敏感性菌株a: 0 μg·mL-1; b: 1 μg·mL-1; c: 5 μg·mL-1; d: 25 μg·mL-1; R: resistant isolate R1，S: sensitive isolate S1

并且隨著處理啶酰菌胺濃度增加(1、5、25 μg·mL-1)，所檢測的兩個菌株體內POD活力也變大。當啶酰菌胺濃度25 μg·mL-1時，抗性菌株R1 POD酶活達到175.26 μmol·min-1，為同條件下敏感性菌株S1 POD(68.43 μmol·min-1)的2.56倍。

2.3 適應性評價

如表1所示，啶酰菌胺抗性菌株R1和敏感性菌株S1在菌絲生長、產孢量、菌絲干重以及對番茄果實的致病性方面沒有明顯的區(qū)別。

表1抗性菌株與敏感性菌株適應性評價

Table1 Adaptive evaluation of resistant strains and sensitive strains

菌株Isolate菌落直徑/cmDiameter產孢量 /106·mL-1Amount of conidia菌株干重/gDry weight病斑大小/cmLesion diameter抗性菌株5.156.810.5231.57敏感菌株5.206.780.5271.56

3 結論與討論

灰霉病一直都是世界范圍內蔬菜生產上的重要病害，因其寄主范圍廣、繁殖快、易變異等特點，給防治工作帶來困難。本試驗檢測了啶酰菌胺抗性菌株R1和敏感性菌株S1的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(PDD)的酶活力，并對兩菌株適應性和致病性進行了分析。實驗結果發(fā)現(xiàn)經不同濃度啶酰菌胺處理后，抗性與敏感性菌株0～24 h內兩種類型菌株PAL和POD活性都有升高趨勢，但是抗性突菌株PAL和POD活性上升幅度較敏感菌株高。適應性評價顯示啶酰菌胺抗性菌株和敏感性菌株在菌絲生長速率、產孢量、菌絲干重以及對寄主植物的致病性方面沒有明顯的區(qū)別。本研究將為啶酰菌胺抗性菌株的抗藥機理分析和田間科學用藥提供理論依據(jù)。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是一類疏水蛋白，分子量一般在300～340 kDa,在生物體內普遍存在，在生物生長發(fā)育過程中及逆境條件下都會發(fā)生變化[14～16]。PAL與植物抗病性密切相關，受到病原物侵染后植物體內PAL活性明顯升高[14]。已有研究報道稱抗藥性真菌的菌株中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，比如葡萄白腐病菌多菌靈抗性菌株體內PAL活性一直高于敏感性菌株[17]；草莓枯萎病菌戊唑醇抗性菌株體內PAL活性明顯高于敏感性菌株[18]；蘋果輪紋病的抗戊唑醇菌株在藥劑處理后1.5 h內酶活性最高[12]。本研究發(fā)現(xiàn)啶酰菌胺處理后，抗性菌株及敏感菌株體內PAL活性均先升高后下降，但是抗性菌株活性一直高于敏感菌株，這與前人研究結果類似。這說明PAL對真菌逆境條件下生存具有調節(jié)作用。

過氧化物酶(PDD)是一類同工酶，能夠催化過氧化氫和有機過氧化物對各種有機物和無機物的氧化作用。POD廣泛存在于動物、植物、真菌及細菌內，依據(jù)來源可分為胞內型、胞外型及分泌型，參與機體多種生理代謝功能[19]。POD參與真菌在逆境條件的生理代謝調節(jié)，保護細胞膜免受損傷[20]。本試驗中，啶酰菌胺處理后24 h內，灰霉菌抗性菌株及敏感性菌株的POD活性呈升高趨勢，并且明顯比后者要高。這與前人研究結果一致，蘋果輪紋病菌抗性菌株及敏感性菌株藥劑處理后體內POD活性一直升高[12]。這說明POD活力大小與真菌抗藥性的強弱有緊密關系，但是能否作為衡量抗性強弱的指征還需要更多的研究工作來證明。

生物適應性參數(shù)是影響一種病原菌抗藥性形成的重要因子，通常包括菌絲生長速率、干重、產孢量以及致病性[21]。本研究發(fā)現(xiàn)啶酰菌胺抗性菌株的適應性參數(shù)值與敏感性菌株無明顯差異。這與前人研究結果一致，有學者發(fā)現(xiàn)具有多種農藥交叉抗性的灰霉菌株其適應性與敏感性無明顯差別[22]。而研究者分析了來源不同寄主的灰霉菌對農藥SYP-1620 的抗性和敏感性菌株的生物適應性發(fā)現(xiàn)，抗性菌株的適應性參數(shù)較低，但是差別不太明顯[7]。這可能與菌株采集的背景有一定關系。

綜上所述，啶酰菌胺處理后，番茄灰霉菌抗性菌株及敏感性菌體的生理生化特征都能發(fā)生顯著變化，PAL及POD活力大幅升高，但是抗性菌株變化幅度更大。而適應性評價顯示兩類菌株無明顯差異，這需要進一步的研究來闡述其原因。番茄灰霉菌是具有抗性風險的病原菌，容易對啶酰菌胺產生抗藥性。新型化學農藥的使用需要科學指導，否則防治效果會下降。