高潔

(山西省林業(yè)科學(xué)研究院,山西 太原 030012)

槐米為豆科植物槐(SophorajaponicaL.)的花蕾，是我國(guó)傳統(tǒng)的大宗藥材之一，內(nèi)含蘆丁、槲皮素等多種黃酮類(lèi)成分，蘆丁為槐米中含量最高的成分。米槐是植物槐的栽培品種。隨著專(zhuān)用于生產(chǎn)槐米的優(yōu)良品種選育成功，植物槐作為行道樹(shù)、四旁樹(shù)、園林綠化樹(shù)和生態(tài)樹(shù)種栽培的同時(shí)，也可作為一種經(jīng)濟(jì)樹(shù)種栽培。人們把專(zhuān)門(mén)用來(lái)生產(chǎn)槐米的植物槐稱(chēng)為米槐。臨床上槐米常用于治療高血壓、冠心病、防治腦溢血及吐血、風(fēng)熱目赤等[1]。1904年，Schmidt分離得到蘆丁，為槐米中的主要成分。隨后，在槐米中分離得到很多黃酮類(lèi)成分，如：染料木素、山柰酚、異鼠李素[2]等。除黃酮類(lèi)外，其他類(lèi)成分，如皂苷類(lèi)[3]、甾類(lèi)[4～5]、色素、氨基酸[6～8]等成分也被發(fā)現(xiàn)。同時(shí)，槐米還可食用、做染料等，槐葉資源豐富，但利用較低，目前對(duì)槐米和槐葉的研究主要集中在化學(xué)和藥理方面，對(duì)于黃酮類(lèi)化合物在槐米和槐葉中的積累規(guī)律及生物合成規(guī)律尚未報(bào)道。

熒光定量PCR技術(shù)(RT-qPCR)是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光材料，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程，然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。通過(guò)RT-qPCR可以分析植物在不同處理?xiàng)l件下基因樣本的表達(dá)差異，比較不同基因型，不同發(fā)育階段或生長(zhǎng)條件下的細(xì)胞或個(gè)體在基因表達(dá)上的差異，是研究分子調(diào)控機(jī)制的重要組成部分。Czechowski等[9]使用RT-qPCR研究了1400多個(gè)擬南芥轉(zhuǎn)錄因子在根組織和莖組織的特異表達(dá)情況，認(rèn)為熒光定量PCR是研究轉(zhuǎn)錄因子的優(yōu)勢(shì)方法。Alaei等[10]用傳統(tǒng)方法和實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)了杭白菊中的白銹病，認(rèn)為實(shí)時(shí)PCR能夠快速準(zhǔn)確的檢測(cè)病原。RT-qPCR也可以為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)提供快速而靈敏的技術(shù)途徑。Wu等[11]建立了轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)體系，為快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物成分提供便捷方法。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可作為分析槐米和槐葉中關(guān)鍵酶基因表達(dá)水平的有利工具。

本研究應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)，對(duì)在前期槐米和槐葉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘到13個(gè)有關(guān)黃酮類(lèi)生物合成的關(guān)鍵酶基因[12]的mRNA的表達(dá)量進(jìn)行熒光定量分析，以期研究槐米中黃酮類(lèi)化合物生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平，明確槐米的采收期，皆在為后續(xù)通過(guò)基因工程進(jìn)行槐米種質(zhì)遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

DYY-6B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，ZF-258全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)，GC-02實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，TC-XP-D 基因擴(kuò)增儀， NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)；RNAisoPlus、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker、M-MLV Reverse Transcriptase、PrimeScrip RT Master Mix、SYBR Premix Ex TaqTM II均為T(mén)aKaRa公司，瓊脂糖(BIOWEST)，DEPC(Solabio)，2×Easy Taq PCR SuperMix (TransGen)。

槐米和槐葉樣品均采自山西省運(yùn)城市鹽湖區(qū)茂端雙季槐種植專(zhuān)業(yè)合作社基地，分別于2016年7月和9月，隨機(jī)抽取同一片試驗(yàn)田中10株生長(zhǎng)旺盛的米槐，每株隨機(jī)從不同部位各采集10包槐米(M)及槐葉(Y)(圖1)，以鋁箔紙包裹，液氮速凍后于-80 ℃保存。采集的所有樣本經(jīng)山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心的秦雪梅教授鑒定為米槐(Sophora japonica)，憑證標(biāo)本保存在該中心。

圖1 槐米和槐葉的生長(zhǎng)狀況Fig.1 The growth status of the Sophora Japonica and its leaves

1.2 RNA提取及cDNA的合成

采用RNAiso Plus(TaKaRa)說(shuō)明書(shū)，對(duì)7月和9月采集的槐米和槐葉樣本進(jìn)行總RNA提取，提取RNA時(shí)，隨機(jī)選取3包樣品進(jìn)行混合。Nano Drop 2000及1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)所提取的RNA樣品進(jìn)行濃度和質(zhì)量檢測(cè)。按照M-MLV Reverse Transcriptase(TaKaRa)說(shuō)明書(shū)用 1μg總RNA合成cDNA。

1.3 熒光定量引物設(shè)計(jì)及驗(yàn)證

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

使用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)槐米和槐葉內(nèi)參18 s rRNA與13個(gè)與黃酮類(lèi)化合物生物合成相關(guān)酶基因的表達(dá)引物，引物的堿基數(shù)為20 bp左右，上下游引物的退火溫度相差1 ℃左右，且都在60 ℃上下浮動(dòng)，符合熒光定量引物設(shè)計(jì)原則。引物合成工作由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.3.2 引物驗(yàn)證

采用PT-PCR驗(yàn)證引物特異性，反應(yīng)體系：12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix；1.0 μL上游/下游引物(引物濃度10 μmol/L)；8.5 μL ddH20；2 μL cDNA。反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 60 s，72 ℃ 3min；35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min；4 ℃保存。選取7月份的槐米為模板，每個(gè)基因各做1個(gè)反應(yīng)，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.4 RT-qPCR分析

反應(yīng)體系：10 μL SYBR Premix Ex Taq；1.0 μL上游/下游引物(引物濃度10 μmol/L)；6.4 μL ddH20；2 μL cDNA。反應(yīng)程序：95 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本生物學(xué)重復(fù)3次，技術(shù)重復(fù)3次。以2-ΔCt值分析數(shù)據(jù)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA樣品質(zhì)量分析

對(duì)所提取的RNA(S7-M、S7-Y、S9-M和S9-Y)進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析(見(jiàn)圖2-A)，由圖可見(jiàn)，有3條完整的電泳條帶，并且28 s比18 s和5s明亮，說(shuō)明RNA的完整性良好，沒(méi)有降解。通過(guò)Nanodrop檢測(cè)RNA的濃度和純度，結(jié)果表明A260/280與A260/230均在1.9～2.1之間，說(shuō)明RNA的純度較高，符合后續(xù)試驗(yàn)要求。

圖2 槐米和槐葉總RNA提取的瓊脂糖凝膠電泳圖及RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖(A-槐米和槐葉總RNA提?。?∶7月槐米；2∶7月槐葉；3∶9月槐米；4∶9月槐葉；B-RT-PCR產(chǎn)物驗(yàn)證：1：柚皮素3-雙加氧酶；2：ANR；3：HCT；4：FLS；5：CHS；6：LDOX；7：FLS；8：LAR；9：F3′H；10：4CL；11：PAL；12：CCoAOMT；13：IFS)Fig.2 The electrophoresis figure of agarose gel extracted from the total RNA of Sophora japonica and its leaves and the electrophoresis figure of agarose gel of RT-PCR products.(A: The extracted total RNA of Sophora japonica and its leaves: 1: Sophora japonica in July;2:Leaves in July; 3: Sophora japonica in September; 4: Leaves in September; The product of B- RT-PCR: 1: EC 1.14.11.9; 2：ANR；3：HCT；4：FLS；5：CHS；6：LDOX；7：FLS；8：LAR；The product of C-RT-PCR: 9：F3′H；10：4CL；11：PAL；12：CCoAOMT；13：IFS)

2.2 引物擴(kuò)增特異性檢驗(yàn)

據(jù)RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖2-B)可知，所設(shè)計(jì)13個(gè)與黃酮類(lèi)化合物生物合成相關(guān)的酶基因的引物均得到特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，且無(wú)引物二聚體。擴(kuò)增目的條帶符合設(shè)計(jì)引物時(shí)目的產(chǎn)物片段的大小，基本在200 bp左右，符合熒光定量反應(yīng)試驗(yàn)要求。

2.3 槐米和槐葉中與黃酮類(lèi)生物合成相關(guān)的酶基因的發(fā)掘

據(jù)本課題組前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析，共注釋到157個(gè)與黃酮類(lèi)化合物生物合成相關(guān)的酶基因(表1)，包括花青素還原酶(c47862_g1，ANR)、黃酮醇合酶(c38192_g1，F(xiàn)LS)、查爾酮合酶(c51726_g1，CHS)、異黃酮2′-羥化酶(c41373_g1，I2'H)等。其中，注釋最多的為4-香豆酸：CoA連接酶同工酶(4CL)，為黃酮類(lèi)化合物生物合成途徑中上游的一個(gè)關(guān)鍵酶。在這157個(gè)酶基因中，高表達(dá)的有13個(gè)，為本研究進(jìn)行熒光定量分析的13個(gè)酶基因。

2.4 與黃酮類(lèi)化合物生物合成相關(guān)酶基因的熒光定量分析

以LAR在9-M(9月份采收的槐米)中的熒光定量擴(kuò)增曲線(見(jiàn)圖3)為例，內(nèi)參18 srRNA和基因LAR在9-M中表達(dá)穩(wěn)定，并且擴(kuò)增良好。由熔解度曲線可知，內(nèi)參18 s rRNA和基因LAR都是一個(gè)尖峰，說(shuō)明設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增良好，無(wú)引物二聚體或其它非特異性擴(kuò)增。

通過(guò)不同采收期(7月和9月)槐米的mRNA表達(dá)量分析，圖4可知，除基因類(lèi)黃酮-3′-羥化酶(F3'H)外，其余基因在7月采收槐米中的表達(dá)量均高于9月；在比較不同部位米槐(槐米和槐葉)中與黃酮類(lèi)物質(zhì)生物合成相關(guān)的酶基因表達(dá)水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，除基因黃酮醇合酶(FLS)、苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)、4-香豆酸：CoA連接酶同工酶(4CL)和2-羥基異黃酮合成酶(IFS)外，其余9個(gè)與黃酮類(lèi)化合物生物合成相關(guān)的酶基因在槐米的表達(dá)量均高于槐葉。由此可推測(cè)，黃酮類(lèi)化合物的積累在7月槐米中較高，9月采收的槐米中黃酮類(lèi)成分減少；且黃酮類(lèi)成分的積累多在槐米中，槐葉中的黃酮類(lèi)成分較少。

表1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中注釋到的與黃酮類(lèi)化合物生物合成相關(guān)的基因Table 1 The Genes Related to the Biosynthesis of Flavonoids in the Transcriptome Data

圖3 內(nèi)參(18 s RNA)與LAR基因在9-M中的熒光定量擴(kuò)增曲線與熔解度曲線Fig.3 Fluorescent Quantitative Amplification Curves and Melting Curves of Internal References (18 s RNA) and LAR Gene in 9-M

圖4 不同采收期槐米和槐葉中黃酮類(lèi)物質(zhì)生物合成相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量Fig.4 The amount of mRNA expression of related genes of the biosynthesis of flavonoids of sophora japonica and its leaves in different harvest time

2.5 槐米和槐葉中與黃酮類(lèi)化合物生物合成相關(guān)關(guān)鍵酶基因的序列比對(duì)

通過(guò)使用國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/對(duì)米槐轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘到的13個(gè)與黃酮類(lèi)化合物生物合成關(guān)鍵酶基因進(jìn)行同源序列比對(duì)由表2可知，13個(gè)酶基因的功能均在其他同源物種中被注釋?zhuān)一蛲葱跃笥?0%。此外，除c85175_g1(HCT)和c56136_g1(IFS)未匹配到蛋白編碼區(qū)外，其余基因均有編碼區(qū)。最長(zhǎng)的基因序列是c56049_g1(LAR)，2 474 bp，其主要功能是無(wú)色花青素還原酶，最短的序列是編碼LDOX的c46064_g1(1 197 bp)。

3 討論與結(jié)論

本研究通過(guò)前期槐米不同采收期(7月和9月)及不同組織部位的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，從中找到13個(gè)黃酮類(lèi)化合物生物合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因，并利用RT-qPCR技術(shù)對(duì)這13個(gè)酶基因mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行分析，明確了槐米的最佳采收期為7月。為后續(xù)黃酮類(lèi)成分生物合成相關(guān)酶基因克隆及功能分析提供數(shù)據(jù)支持，為通過(guò)基因工程進(jìn)行米槐種質(zhì)遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

通過(guò)前期米槐轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的深度挖掘，找出157個(gè)與黃酮類(lèi)生物合成相關(guān)的基因，并在其中找出13個(gè)表達(dá)上調(diào)的關(guān)鍵酶基因，隨后對(duì)這13個(gè)酶

表2槐米和槐葉中與黃酮類(lèi)化合物生物合成相關(guān)關(guān)鍵酶基因的序列比對(duì)

Table2 The sequence alignment of key enzyme genes related to biosynthesis of flavonoids in the Sophora Japonica and its leaves

Gene IDFunctionlength(bp)Homologous species functionHomology rateHomologous gene length(bp)Gene bank IDc49346_g1Naringenin, 2-oxoglutar-ate 3-dioxygenase1676Glycine max flavanone 3-hydroxylase (F3H) mRNA, complete cds85%1677DQ513328.1c47862_g1Anthocyanidn reductase1803Lotus uliginosus anthocyanidin reductase (ANR) mR-NA, complete cds88%1161/c85175_g1HCT;shikimate O-hydroxycinnamoyltrans-ferase1862PREDICTED: Glycine max spermidine hydroxycin-namoyl transferase-like (LOC100777007), mRNA79%1646/c43880_g1Flavonol synthase1490Onobrychis viciifolia flavonol synthase mRNA, complete cds84%1005HM204484.1c51726_g1Chalcone and stilbene synthase family protein2018Acacia confusa chalcone synthase mRNA, complete cds85%1577JN812063.1c46064_g1Leucoanthocyanidin diox-ygenase LDOX1197Glycine max anthocyanidin synthase 3 (ANS3) mRNA, complete cds88%1308AY382830.1c31170_g1Flavonol synthase1572Eustoma russellianum flavonol synthase (fls) mRNA, complete cds73%1268AF240764.1c56049_g1Leucoanthocyanidin re-ductase LAR2474Glycine max cultivar Clark leucoanthocyanidin reductase 1 (LAR1) mRNA, complete cds85%1314JF433916.1c40901_g1Flavonoid-3'-hydroxylase1944Glycine max flavonoid 3'-hydroxylase (F3'H) mRNA, complete cds83%1589 FJ770476.1c53277_g14-Coumarate: CoA ligase isoenzyme 32130Glycine max 4-coumarate:CoA ligase (4CL) mRNA, complete cds84%1697FJ770469.1c53596_g1Phenylalanine ammonia-lyase class 1-like2176Vitis vinifera phenylalanine ammonia-lyase 1 (PAL1) mRNA, complete cds78%2154KU162973.1c50834_g1Cinnamoyl-CoA O-meth-yltransferase1258Caragana korshinskii cinnamoyl-CoA O-methyltrans-ferase (CCOAOMT) mRNA, complete cds91%744HQ829864.1c56136_g12-Hydroxyisoflavanone synthase2009PREDICTED: Lupinus angustifolius 2-hydroxyisofla-vanone synthase-like (LOC109328965), mRNA80%1703/

基因進(jìn)行同源性比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示除c85175_g1(HCT)和c56136_g1(IFS)未匹配到蛋白編碼區(qū)外，其余基因均有編碼區(qū)。此結(jié)果表明，所找到的黃酮類(lèi)化合物生物合成途徑中表達(dá)上調(diào)的基因多數(shù)為全長(zhǎng)基因，并不是以小片段形式存在的，所以關(guān)于酶基因的功能注釋結(jié)果是可信的，并且基因注釋結(jié)果與同源全長(zhǎng)基因的結(jié)果相匹配。通過(guò)RT-qPCR技術(shù)對(duì)這13個(gè)酶基因的mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中9個(gè)基因mRNA的表達(dá)量在槐米中均高于槐葉，且在比較不同采收期槐米中與黃酮類(lèi)物質(zhì)生物合成相關(guān)的酶基因表達(dá)水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，除F3'H外，其余基因在7月采收槐米中的表達(dá)量均高于9月，這為確定槐米的采收期提供了理論支持。

目前，人們致力于槐米中藥用成分的研究，主要是化學(xué)和藥理方面?；瘜W(xué)研究主要集中在槐米中蘆丁與槲皮素的含量測(cè)定、提取及純化工藝研究；藥理作用的研究主要為黃酮類(lèi)化合物(蘆丁、槲皮素)的抗炎、止血、抗病毒及心血管疾病等?；比~資源豐富，但利用率較低，為了提高槐葉的附加價(jià)值，李彩霞等[13]采用ABTS清除體系、DPPH清除體系、H2O2/ Fe2 +/水楊酸檢測(cè)體系、亞硝基清除體系、普魯士藍(lán)法、鄰苯三酚自氧化法研究了國(guó)槐葉黃酮的抗氧化活性，并同蘆丁、Vc進(jìn)行了比較，說(shuō)明國(guó)槐葉提取物可以作為天然抗氧化劑，并且可以應(yīng)用在醫(yī)藥食品領(lǐng)域。李小勇等[14]研究超聲波輔助雙水相、回流、半仿生、水提、超聲波輔助雙水相(堿)性5種提取方法提取國(guó)槐葉黃酮以及抗氧化活性。結(jié)果表明，回流提取黃酮含量大于其它幾種提取方法?？寡趸Y(jié)果顯示，超聲輔助雙水相提取物具有很好的抗氧化性。以上研究表明目前對(duì)槐米和槐葉中的主要活性物質(zhì)黃酮類(lèi)化合物研究較多，但黃酮類(lèi)化合物的積累規(guī)律及生物合成規(guī)律在米槐中的研究尚未報(bào)道，但在其他植物中的研究較廣泛。PAL(苯丙氨酸解氨酶)是類(lèi)黃酮生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，其能催化L-苯丙氨酸非氧化性脫氨生成反式肉桂酸。Liu等[15]克隆得到蒙古黃芪PAL1基因，并將該基因CaMV35S啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入到煙草中，研究發(fā)現(xiàn)煙草中PAL酶活和槲皮素的含量升高，證明了PAL是蒙古黃芪黃酮化合物合成途徑中的關(guān)鍵酶。CHI(查耳酮異構(gòu)酶)也是黃酮類(lèi)化合物代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，第1個(gè)CHI基因是Mehdy等[16]于1987年從法國(guó)豌豆中得到的，CHI能使查爾酮發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化。Liu等[15]克隆得到花生的CHI基因并通過(guò)RT-qPCR分析，結(jié)果顯示CHI基因主要在根系中表達(dá)。不同種類(lèi)的黃酮類(lèi)化合物在植物各組織中的分布情況不同。Graham[17]研究發(fā)現(xiàn)，在大豆萌芽后5天時(shí)，幼苗的根部組織、胚軸以及子葉中異黃酮類(lèi)化合物含量高，而初生的葉片組織中主要是黃酮醇類(lèi)成分，這可能與合成不同黃酮類(lèi)化合物的酶的含量及活性有組織差異性有關(guān)。黃酮醇類(lèi)物質(zhì)大部分分布于葉和花中，而異黃酮類(lèi)化合物多在豆科植物的根中分布。本項(xiàng)目研究通過(guò)將在米槐轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到的13個(gè)與黃酮類(lèi)生物合成相關(guān)的基因注釋到黃酮類(lèi)化合物生物合成途徑中，揭示了米槐中黃酮類(lèi)成分的積累及生物合成規(guī)律。研究結(jié)果F3'H和FLS主要參與黃酮醇類(lèi)化合物的生物合成，槐米中含量最高的蘆丁屬于此類(lèi)化合物，由基因表達(dá)量分析可知，與槐葉相比，黃酮醇類(lèi)化合物的積累在槐米中較高，且7月份采收的槐米比9月份含量高?；泵诪槲撮_(kāi)放的花蕾，槐米與槐花中的蘆丁含量相似，且槐米中含有更多的黃酮類(lèi)物質(zhì)，本研究結(jié)果與諸姮[18]總結(jié)結(jié)果一致，而本研究發(fā)現(xiàn)異黃酮類(lèi)物質(zhì)的合成主要在葉中，與異黃酮類(lèi)化合物多在豆科植物的根中分布結(jié)論不一致，這可能是因?yàn)?，本研究?jī)H在2個(gè)組織中分析與黃酮類(lèi)化合物生物合成相關(guān)的酶基因表達(dá)水平，未就槐枝、槐根等其他組織進(jìn)行研究。結(jié)合黃酮類(lèi)化合物的生物合成路徑與熒光定量結(jié)果可以推測(cè)，異黃酮類(lèi)物質(zhì)可以通過(guò)采收槐葉獲得，而通過(guò)采收槐米可能獲得更高的黃酮醇及花色素類(lèi)物質(zhì)。從而為通過(guò)提取分離獲得目標(biāo)化合物提供依據(jù)，也可為后續(xù)黃酮類(lèi)成分生物合成相關(guān)酶基因克隆及功能分析提供數(shù)據(jù)支持。