高 敏，張 敏，鄭曉冬，周伏圣，李 揚(yáng)

白癜風(fēng)(vitiligo)是一種局限性或者泛發(fā)性的色素減退/脫失性疾病。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為白癜風(fēng)是一種復(fù)雜疾病，遺傳和環(huán)境因素共同作用從而導(dǎo)致白癜風(fēng)的發(fā)生和進(jìn)一步發(fā)展。前期研究[1]通過全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome wide association study, GWAS)的方法在中國漢族人群中發(fā)現(xiàn)染色體6q27的一個(gè)約200 kb的區(qū)域與中國漢族人群白癜風(fēng)的發(fā)病顯著相關(guān)，同時(shí)通過基因分型的方法檢測了大量可疑的易感單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)。

國外學(xué)者Jin et al[2]在1 514歐美高加索白人白癜風(fēng)患者和813例與之相匹配的健康對照者中進(jìn)行了GWAS研究，發(fā)現(xiàn)PTPN22、RERE、GZMB、C1QTNF6和UBASH3A這5個(gè)基因的多態(tài)性位點(diǎn)與白癜風(fēng)的發(fā)病密切相關(guān)。為了驗(yàn)證這些基因是否與中國漢族人群白癜風(fēng)發(fā)病具有相關(guān)性，該研究團(tuán)隊(duì)檢索了白種人數(shù)據(jù)庫，利用國際單體型計(jì)劃(HapMap)中的Haploview軟件，篩選了上述5個(gè)基因的8個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行深入研究，以期探討上述基因與中國漢族人群白癜風(fēng)發(fā)病是否相關(guān)。

1 材料與方法

1.1病例資料

1.1.1入選標(biāo)準(zhǔn) 在全國范圍內(nèi)收集了漢族人群白癜風(fēng)患者1 977例，其中男993例，女984例；年齡12～64(27.64±14.46)歲。確診標(biāo)準(zhǔn)：所有病例經(jīng)Wood燈檢測后，由至少兩位副高以上的副主任醫(yī)師確診。此外，收集健康對照人群2 024例，其中男1 081例，女943例；年齡14～65(26.20±12.27)歲，要求其親屬無白癜風(fēng)以及其他自身免疫性或者系統(tǒng)性疾病。本研究符合赫爾辛基宣言原則且經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。每位入選人員抽取靜脈血3～5 ml，置于EDTA-Na2抗凝管，放入-80 ℃冰箱保存。

1.1.2臨床分組及分層分析 按照首次發(fā)病年齡劃分：≤20歲稱為早發(fā)型白癜風(fēng)；>20歲稱為晚發(fā)型白癜風(fēng)。按照先證者一、二、三級家屬中有無白癜風(fēng)患者分為有家族史和無家族史患者兩組。

1.2SNP位點(diǎn)的選擇查閱文獻(xiàn)以及UCSC、NCBI數(shù)據(jù)庫，結(jié)合國際單體型計(jì)劃利用Haploview軟件，篩選出位于PTPN22、RERE、GZMB、C1QTNF6和UBASH3A這5個(gè)基因上的8個(gè)TagSNPs位點(diǎn)進(jìn)一步研究。

1.3研究方法

1.3.1基因組DNA的提取和標(biāo)化 參照Qiagen公司的Flexi Gene DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，紫外分光光度計(jì)測其濃度后將其標(biāo)準(zhǔn)化至15～20 ng/μl備用。

1.3.2引物設(shè)計(jì) 在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取上述8個(gè)SNP位點(diǎn)的序列，利用Assay Designer3.1軟件設(shè)計(jì)引物。上海生工合成引物后進(jìn)行稀釋待用。

1.3.3基因分型 PCR擴(kuò)增獲得DNA片段，經(jīng)電泳、純化后在Sequenom Massarray iPLEX系統(tǒng)(美國Sequenom公司)上對篩選出的8個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分型。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理PLINK 1.07軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg(HWE)平衡檢驗(yàn)和最小等位基因頻率(MAF)計(jì)算。采用SPSS 16.0軟件計(jì)算優(yōu)勢比(odds ratio，OR)、95%可信區(qū)間(confidence intervals，CI)和P值，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1基因分型PTPN22、RERE、GZMB、C1QTNF6 和UBASH3A基因上的多態(tài)性位點(diǎn)rs2476601、rs301819、rs4908760、 rs11121194、rs8192917、rs5756546、rs11203203和rs2839511在1 977例白癜風(fēng)患者和2 024例健康對照者間無顯著相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

2.2基因型-表型分析

2.2.1按照早發(fā)/晚發(fā)型分組 在1 977例白癜風(fēng)患者中，早發(fā)型患者與晚發(fā)型患者兩組之間的基因型以及等位基因頻率分布上的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2.2按照有/無家族史分組 207例患者具有家族史，1 764例患者無家族史，6例患者家族史不詳。位于RERE基因上的SNP位點(diǎn)rs4908760的等位基因頻率在有家族史和無家族史患者中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.024)，基因型頻率在兩組患者之間差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012)(表2)，但對上述結(jié)果進(jìn)行組間比較校正后，結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；位于GZMB基因上的SNP位點(diǎn)rs8192917的基因型頻率在有家族史和無家族史患者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)，但其等位基因頻率在兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

3 討論

白癜風(fēng)是一種多基因遺傳的復(fù)雜性皮膚病，其發(fā)病機(jī)制未明，但是遺傳因素在其發(fā)病機(jī)制中的作用得到廣泛認(rèn)同。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)和高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，白癜風(fēng)的遺傳學(xué)研究取得了較大的進(jìn)展，尤其是國內(nèi)外學(xué)者運(yùn)用GWAS，發(fā)現(xiàn)了許多有意義的白癜風(fēng)易感基因及位點(diǎn)[3]。 國外學(xué)者Spritz 團(tuán)隊(duì)完成了歐美人群白癜風(fēng)的 GWAS研究，結(jié)果顯示尋常型白癜風(fēng)與某些自身免疫性疾病相關(guān)聯(lián)的基因具有相關(guān)性，如本研究中的GZMB、RERE、PTPN22、UBASH3A和C1QTNF6基因。

表1 8個(gè)SNPs位點(diǎn)的等位基因頻率在病例和對照組間的比較

表2 在有無家族史患者中rs4908760的基因型和等位基因分布

表3 在有無家族史患者中rs8192917的基因型和等位基因分布

PTPN22基因編碼蛋白絡(luò)氨酸磷酸酶家族非受體4型亞科。研究[4]顯示該基因的多態(tài)性與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病明顯相關(guān)。Jin et al[2]研究發(fā)現(xiàn)其SNP 位點(diǎn) rs2476601與歐美人群白癜風(fēng)發(fā)病具有相關(guān)性。UBASH3A基因編碼T細(xì)胞泛素配體家族，可以負(fù)向調(diào)節(jié)T細(xì)胞信號，與糖尿病的發(fā)病密切相關(guān)，其SNP位點(diǎn)rs11203203和rs2839511與歐美人群白癜風(fēng)發(fā)病相關(guān)[5]。C1QTNF6基因是C1q和腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白6，與中國漢族人群Graves’病的發(fā)生具有相關(guān)性，該基因的多態(tài)性位點(diǎn)rs5756546與歐美人群白癜風(fēng)發(fā)病相關(guān)[6]。但是本研究中并未顯示上述三個(gè)基因的多態(tài)性位點(diǎn)與中國漢族人群白癜風(fēng)發(fā)病具有相關(guān)性。

RERE基因位于染色體1q36.23區(qū)域，該基因編碼精氨酸谷氨酸的酸二肽重復(fù)蛋白質(zhì)，其超表達(dá)可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡，有研究[7]表明其與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常有關(guān)。Jin et al[2]研究發(fā)現(xiàn)RERE基因上的SNP位點(diǎn)rs1121194、rs4908760和rs301819與高加索人群白癜風(fēng)的發(fā)病有關(guān)。本研究顯示該基因上的SNP位點(diǎn)rs4908760的等位基因頻率在有家族史和無家族史患者中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.024)，基因型頻率在兩組之間也具有差異性，但是經(jīng)過校正后，差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

GZMB基因又稱顆粒酶 B，能夠被細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞和 NK 細(xì)胞識別，從而溶解特定的靶細(xì)胞，在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用，有研究[8]表明該基因與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生具有相關(guān)性。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)其SNP位點(diǎn)rs8121917與歐美高加索人群白癜風(fēng)發(fā)病有關(guān)[2]。本研究顯示該SNP位點(diǎn)的基因型頻率在有無家族史患者中存在差異(P=0.008)，但等位基因頻率在兩組患者之間無差異。

本研究并未顯示上述8個(gè)SNP位點(diǎn)與中國漢族人群白癜風(fēng)的發(fā)病明顯相關(guān)，其原因考慮如下：① 遺傳異質(zhì)性：歐美高加索白種人群與中國漢族黃種人群在白癜風(fēng)的遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制中具有明顯的遺傳異質(zhì)性，其特有的易感基因位點(diǎn)不是中國漢族人群白癜風(fēng)的易感基因位點(diǎn)；② SNP 位點(diǎn)存在異質(zhì)性：因?yàn)椴煌N人群的TagSNPs可能不同，并且TagSNPs無法覆蓋整個(gè)基因，故而會導(dǎo)致中國漢族人群中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與歐美人群存在差異；③ 樣本量可能不足：本研究顯示某些致病SNP 位點(diǎn)對疾病的效力可能比較微弱，故而不一定能夠被檢測出，因此，以后可以通過進(jìn)一步加大樣本量以及提高SNP的密度來驗(yàn)證這些易感位點(diǎn)與中國漢族人白癜風(fēng)發(fā)病的相關(guān)性。

該研究雖未能在中國漢族人群中成功驗(yàn)證RERE、PTPN22、GZMB、UBASH3A和C1QTNF6基因的多態(tài)性位點(diǎn)與白癜風(fēng)的相關(guān)性，但并不表明這5個(gè)基因在漢族人白癜風(fēng)發(fā)病中不起作用，如有可能，將來可通過全基因測序的方法來真正發(fā)現(xiàn)這些基因與漢族人群白癜風(fēng)發(fā)病的關(guān)聯(lián)。此外，由于白癜風(fēng)發(fā)病復(fù)雜，環(huán)境因素在其發(fā)病中也起了至關(guān)重要的作用，將來可以通過其他手段，如蛋白質(zhì)芯片、表達(dá)譜芯片和甲基化芯片從多方面來發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)發(fā)病的病因，從而為早期診斷、干預(yù)和治療奠定基礎(chǔ)。