徐 恰，阮 昕，汪慎燚，席 浩，韋文美,2，秦宜德

卵巢癌致死率高，早期癥狀不典型，組織類型和良惡性難以診斷，因此女性卵巢癌患者的治愈率較低[1-3]。以鉑類和紫杉醇為主的臨床化療治療藥物耐藥性的產(chǎn)生[4]，抑制了患者對(duì)化療藥物的敏感性，治療效果達(dá)不到理想效果。所以，提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，防止耐藥性的發(fā)生，增強(qiáng)療效對(duì)卵巢癌治療具有重要意義。文獻(xiàn)[5-6]表明，除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(excision repair cross complementing1，ERCC1)表達(dá)量多少與卵巢癌耐藥性有關(guān)聯(lián)，其過(guò)表達(dá)可降低鉑類化療藥物的治療效果，ERCC1在人卵巢癌耐藥細(xì)胞株COC1/DDP中的表達(dá)量較高。乳源六肽是一組來(lái)源于牛乳β-酪蛋白的短肽，其氨基酸序列為Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn。前期研究[7-11]表明，PGPIPN可以抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV3和SKOV3/DDP的生長(zhǎng)和增殖，但效果不及目前正在使用的抗癌藥DDP和紫杉醇等。該研究通過(guò)不同濃度的PGPIPN聯(lián)合DDP，研究對(duì)人卵巢癌敏感細(xì)胞株COC1和耐藥細(xì)胞株COC1/DDP增殖和凋亡的影響，并討論其可能的機(jī)制，為開(kāi)發(fā)治療卵巢癌的新方案和治療新藥提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料人卵巢癌敏感細(xì)胞株COC1和耐藥細(xì)胞株COC1/DDP購(gòu)自中科院細(xì)胞所的細(xì)胞庫(kù)；RPMI-1640(美國(guó)Gibico公司)；PGPIPN(上海楚肽生物科技有限公司)；胎牛血清(浙江天杭生物技術(shù)公司)；順鉑注射液(山東齊魯制藥有限公司)；流式凋亡試劑盒(上海貝博公司)；CCK8(江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司)；β-actin鼠抗人抗體(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)；ERCC1兔抗人抗體(美國(guó)Abcam公司)；Reverse Trsnscription System(日本TaKaRa公司)；DMSO(北京Solarbio科技有限公司)；TRIzol(美國(guó)Thermo Fisher公司)。

1.2方法

1.2.1卵巢癌細(xì)胞株的培養(yǎng) 細(xì)胞的培養(yǎng)均用RPMI-1640培養(yǎng)基(含雙抗)，10%胎牛血清，培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。在維持COC1/DDP細(xì)胞良好生長(zhǎng)的前提下，逐步用0.1～0.6 μg/ml的DDP進(jìn)行刺激。

1.2.2CCK8法測(cè)定DDP的半數(shù)抑制濃度(IC50) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞, 制成細(xì)胞懸液, 接種至96孔板, 37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜, 每孔加入不同濃度的DDP繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。每孔加入10 μl CCK8溶液繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450 nm處測(cè)定各孔吸光度 (optical density, OD) 值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)各組中各孔OD平均值, 計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率和IC50值。

1.2.3細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的測(cè)定 CCK8法測(cè)定細(xì)胞的成活，檢查藥物對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組、DDP組、PGPIPN組、DDP和低劑量肽聯(lián)合組、DDP和中劑量肽聯(lián)合組、DDP和高劑量肽聯(lián)合組等6組，分別給與生理鹽水、1×10-4g/L PGPIPN、DDP(IC50)、DDP(IC50)+1×10-6g/L PGPIPN、DDP (IC50)+1×10-4g/L PGPIPN、DDP(IC50)+1×10-2g/L PGPIPN干預(yù)。將COC1、COC1/DDP以適宜的細(xì)胞密度種于96孔板中，每孔100 μl，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培育過(guò)夜。次日，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，棄培養(yǎng)基，每孔加入事先配好濃度的藥物100 μl, 以等量完全培養(yǎng)基和相同濃度DDP組作為空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，每組各設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，于培養(yǎng)箱中分別培育24、48、72 h。待到作用時(shí)間，每孔10 μl CCK8加入到每孔中，培養(yǎng)箱中孵育4 h，將酶標(biāo)儀波長(zhǎng)調(diào)整為450 nm，測(cè)定96孔板的OD值。細(xì)胞存活率(%)=(OD實(shí)驗(yàn)組/OD空白對(duì)照組)×100%。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將COC1、COC1/DDP分別種于兩個(gè)6孔板中，加不同濃度藥物，培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min, PBS潤(rùn)洗3次。每管加入300 μl Binding Buffer和4 μl Annexin V-FITC懸浮細(xì)胞, 4 ℃避光孵育15 min后加入7.5 μl PI, 2～8 ℃避光孵育5 min后立即在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果用Flowjo 7.6.1軟件進(jìn)行分析。

1.2.5RT-PCR檢測(cè)ERCC1基因mRNA的表達(dá) 用Primer-Bank檢索引物的序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)β-actin，ERCC1的引物序列，送至上海生工生物公司合成。使用TRIzol試劑提取細(xì)胞RNA,用Reverse Trsnscription System試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,加入引物PCR擴(kuò)增。使用TRIzol試劑提取細(xì)胞RNA,用Reverse Trsnscription System試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,加入引物PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，采集圖像進(jìn)行光密度掃描。引物序列見(jiàn)表1。

表1 β-actin、ERCC1引物序列、片段大小和退火溫度

1.2.6Western blot檢測(cè) 將COC1、COC1/DDP分別用不同濃度的藥物(每個(gè)濃度藥物設(shè)置3個(gè)復(fù)孔)刺激48 h后，BCA法對(duì)各組細(xì)胞蛋白進(jìn)行定量10% SDS-PAGE凝膠電泳，250 mA、75 min轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入ERCC1、β-actin一抗4 ℃搖床過(guò)夜，加入二抗，室溫孵育2 h，ECL發(fā)光顯影。

2 結(jié)果

2.1聯(lián)合用藥對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響根據(jù)從CCK8實(shí)驗(yàn)和GraphyPad Prism 5.0軟件分析，經(jīng)DDP作用后，COC1細(xì)胞的IC50值在24、48、72 h分別是(6.79×10-3±2.632)、(7.73×10-3±3.148)、(6.87×10-3±3.244 )g/L，而COC1/DDP細(xì)胞的IC50值在24、48、72 h分別是(15.37×10-3±4.873)、(17.82×10-3±5.019)、(16.51×10-3±4.639)g/L。

從聯(lián)合用藥的結(jié)果看，PGPIPN能顯著促進(jìn)DDP對(duì)COC1、COC1/DDP的增殖抑制，見(jiàn)圖1。聯(lián)合用藥能顯著提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性，而且對(duì)PGPIPN具有計(jì)量依賴性。卵巢癌耐藥細(xì)胞株COC1/DDP的增敏效果明顯高于卵巢癌敏感細(xì)胞株COC1，與DDP組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1。

2.2聯(lián)合用藥對(duì)卵巢癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響由CCK8結(jié)果可知，藥物作用48 h對(duì)細(xì)胞抑制效果最佳，實(shí)驗(yàn)均選取48 h作為作用時(shí)間，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測(cè)，COC1組其DDP抑制細(xì)胞增殖的平均IC50值在48 h為(7.73×10-3±3.148) g/L，COC1/DDP組其DDP抑制細(xì)胞增殖的平均IC50值在48 h為(17.82×10-3±5.019) g/L。

結(jié)果可見(jiàn)，PGPIPN能顯著促進(jìn)DDP誘導(dǎo)COC1、COC1/DDP細(xì)胞凋亡，見(jiàn)圖2。聯(lián)合用藥能顯著提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性， PGPIPN具有計(jì)量依賴性。卵巢癌耐藥細(xì)胞株COC1/DDP的增敏效果明顯高于卵巢癌DDP敏感細(xì)胞株COC1，與DDP組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (FCOC1=104.491,P<0.05；FCOC1/DDP=375.810，P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖1 DDP聯(lián)合不同濃度PGPIPN對(duì)卵巢癌細(xì)胞株COC1、COC1/DDP增殖的影響

A：COC1;B：COC1/DDP;1:陰性對(duì)照組;2:DDP組;3:PGPIPN組;4:DDP和低劑量肽聯(lián)合組;5:DDP和中劑量肽聯(lián)合組;6:DDP和高劑量肽聯(lián)合組;與DDP組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖2 DDP聯(lián)合不同濃度PGPIPN對(duì)COC1、COC1/DDP凋亡的影響

A：COC1凋亡圖；B:COC1/DDP凋亡圖；1：陰性對(duì)照組；2：DDP組；3：PGPIPN組；4：DDP和低劑量肽聯(lián)合組；5：DDP和中劑量肽聯(lián)合組；6：DDP和高劑量肽聯(lián)合組

2.3RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因mRNA表達(dá)的變化由實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3)可知，耐藥株COC1/DDP細(xì)胞ERCC1表達(dá)量比敏感株COC1細(xì)胞的高。同DDP組比較，聯(lián)合用藥組ERCC1的mRNA水平降低，作用效果隨著PGPIPN用藥濃度的增加而增強(qiáng)(FCOC1=279.601、FCOC1/DDP=136.033，P<0.05，P<0.01)。PGPIPN對(duì)ERCC1的mRNA抑制效果，卵巢癌耐藥細(xì)胞株COC1/DDP明顯高于卵巢癌DDP敏感細(xì)胞株COC1(只在高濃度的PGPIPN才顯著降低mRNA水平)。

圖3 RT-PCR檢測(cè)COC1、COC1/DDP相關(guān)基因mRNA表達(dá)的變化

A：COC1的ERCC1基因RT-PCR的電泳圖; B：COC1/DDP的ERCC1基因RT-PCR的電泳圖; C: 基因ERCC1表達(dá)的mRNA相對(duì)定量統(tǒng)計(jì)圖；M: Marker;1:陰性對(duì)照組; 2:DDP組;3:PGPIPN組;4:DDP和低劑量肽聯(lián)合組;5:DDP和中劑量肽聯(lián)合組;6:DDP和高劑量肽聯(lián)合組;與DDP組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.4Westernblot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)的變化DDP聯(lián)合不同濃度PGPIPN作用于COC1/DDP和COC1細(xì)胞后，ERCC1蛋白明顯降低，見(jiàn)圖4。同DDP組比較，聯(lián)合用藥下，耐藥細(xì)胞株COC1/DDP的ERCC1水平顯著降低，作用效果隨著PGPIPN用藥濃度的增加而增強(qiáng)(FCOC1=73.269，P<0.05，P<0.01)；而對(duì)敏感細(xì)胞株COC1，在高濃度的PGPIPN下也能顯著降低ERCC1的水平(FCOC1/DDP=97.431,P<0.05)。從結(jié)果看，PGPIPN對(duì)ERCC1的抑制，卵巢癌耐藥細(xì)胞株COC1/DDP明顯高于敏感細(xì)胞株COC1。PGPIPN對(duì)ERCC1蛋白的抑制規(guī)律與抑制該基因mRNA相一致。

圖4 Western blot檢測(cè)COC1和COC1/DDP相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

A：COC1的ERCC1蛋白的Western blot的電泳圖; B：COC1/DDP的ERCC1蛋白的Western blot的電泳圖; C: ERCC1蛋白相對(duì)定量統(tǒng)計(jì)圖，1:陰性對(duì)照組;2:DDP組;3:PGPIPN組;4:DDP和低劑量肽聯(lián)合組;5:DDP和中劑量肽聯(lián)合組;6:DDP和高劑量肽聯(lián)合組;與DDP組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

卵巢惡性腫瘤在臨床上的主要醫(yī)治措施是早發(fā)現(xiàn)和早期切除。目前的治療難題是卵巢癌較易轉(zhuǎn)移至機(jī)體的其他部位，患者手術(shù)后容易再次病發(fā)，因而，如何控制復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是卵巢癌治療的熱點(diǎn)。加上患者化療耐藥的影響，進(jìn)一步降低了卵巢癌治愈率。鉑類如順鉑是治療卵巢癌常用的化療藥物，但是很多患者出現(xiàn)了耐藥的現(xiàn)象。因此，如若能摸索出卵巢癌化療耐藥的分子機(jī)制，提高化療敏感性和逆轉(zhuǎn)耐藥性，對(duì)其治療非常有意義。

近年來(lái)有很多關(guān)于ERCC1與卵巢癌耐藥直接關(guān)系的研究。研究[12-14]已表明，接受過(guò)順鉑化療藥物的患者中，ERCC1呈高劑量表達(dá)。所以，若能干擾ERCC1基因的表達(dá)，便能實(shí)現(xiàn)增加卵巢癌對(duì)化療藥物的敏感性，達(dá)到治療卵巢癌治愈的目的。ERCC1的高表達(dá)可以修復(fù)癌細(xì)胞中受損傷的DNA分子，增加存活的癌細(xì)胞，從而產(chǎn)生耐藥。PGPIPN能顯著促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性和紅細(xì)胞免疫，前期研究顯示PGPIPN能通過(guò)某些信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性?？赡艿臋C(jī)制是抑制抑制由順鉑等引起的卵巢癌細(xì)胞抗凋亡蛋白過(guò)表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。

PGPIPN作為一種抗癌活性肽，副作用低，對(duì)正常人體細(xì)胞幾乎無(wú)損傷，在未來(lái)的臨床應(yīng)用中將具有廣闊的應(yīng)用前景。