魏 操，翟素珍，邰勝燕，肖永珊，張春林

創(chuàng)傷修復(fù)一直是醫(yī)學(xué)外科領(lǐng)域里面臨的最基本最重要的問題之一。隨著中草藥在創(chuàng)面愈合中的作用越來越重要[1]，美洲大蠊(PeriplanetaAmericanaL.)為蜚蠊目蜚蠊科(BlattidaeHandlirsch)大蠊屬(Periplaneta)昆蟲，其藥用可追溯到《神農(nóng)本草經(jīng)》，基于美洲大蠊提取物具有抗腫瘤、抗衰老、保肝、強心、修復(fù)潰瘍創(chuàng)面等功效，該藥對創(chuàng)面修復(fù)的臨床療效良好并得到驗證[2]，但仍存在如蟑螂藥用活性成分不明、藥理機制不清楚等諸多問題。鑒于此，該研究建立了大鼠皮膚切創(chuàng)模型，觀察美洲大蠊粗提物(PeriplanetaAmericanaextract，PAE)對創(chuàng)口愈合過程中的作用，檢測血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和CD68的表達，旨在觀察PAE促進創(chuàng)傷修復(fù)及其藥理作用的機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器HE、Cy-3染色試劑盒(北京索萊寶公司)；CD68抗體(英國Abcam公司)；VEGF抗體(武漢Boster公司)；bFGF抗體(美國Immunaly公司)；β-actin一抗和羊抗兔二抗(北京博奧森公司)；正置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；石蠟切片機(德國LEICA公司)； DK-8D型電熱恒溫水槽(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮公司)；DYCP-40E型電泳儀(北京六一儀器廠)；蛋白電泳儀(北京百晶生物技術(shù)有限公司)；凝膠圖像處理系統(tǒng)(美國伯樂公司)；Bullet Blender組織細胞破碎儀(北京海德創(chuàng)業(yè)生物科技有限公司)；京萬紅藥膏(天津藥業(yè)有限公司)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z12020440。

1.2實驗動物選用SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量 (200±20)g，飼養(yǎng)溫度22 ℃，濕度55%～65%，由陸軍醫(yī)學(xué)院附屬大坪醫(yī)院實驗動物中心提供。

1.3PAE的制備[3]稱美洲大蠊100 g，粉碎成粗粉，于50 ℃下烘干，用85%乙醇4 ℃浸泡過夜，依次加7、5、3倍量85%乙醇于60 ℃浸泡2、1.5、1 h，合并3次提取液，趁熱過濾，減壓回收乙醇至粘稠膏狀，再加入1 L溫?zé)岬恼麴s水，攪拌、靜置，于 4 ℃過夜，除去上層油狀物。剩余水溶液加入石油醚萃取，靜置，取下層水溶液及沉淀，濃縮成稠膏，冷凍干燥得浸膏。

1.4實驗方法

1.4.1動物分組 將SPF級SD大鼠60只隨機分為5組：模型組12只，京萬紅組12只，PAE高、中、低組各12只。

1.4.2動物模型的制備 動物模型制備參照文獻[4]。大鼠常規(guī)飼養(yǎng)3 d后，7.2%水合氯醛(0.5 ml/100 g)腹腔注射麻醉成功后，備皮，75%的酒精局部消毒手術(shù)區(qū)，于耳連線中間向下4 cm背部近頸側(cè)以脊柱為中線位制作1.5 cm×1.5 cm全層皮膚創(chuàng)口，深至肌層，形成機械損傷動物模型。

1.4.3給藥方法 PAE高中低劑量組分別外涂PAE 250、125、62.5 mg/(g·d)；京萬紅治療組外涂京萬紅藥膏0.1 g/d；模型組常規(guī)飼養(yǎng)，不作任何處理。其余4組每日定時局部涂抹給藥1次，持續(xù)給藥14 d。

1.5觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1創(chuàng)面大體觀察 建模后肉眼觀察創(chuàng)面有無紅腫、滲液及感染，創(chuàng)口收縮和表面結(jié)痂的情況。

1.5.2創(chuàng)面愈合率 分別在建模后的第3、7、14天攝取每組大鼠的創(chuàng)面圖像，采用圖像分析軟件(Image J)計算創(chuàng)面面積，得出創(chuàng)面愈合率。

1.5.3病理組織學(xué)觀察 從4%多聚甲醛固定液取出組織快，自來水沖洗3～4 h，行常規(guī)脫水、包埋、切片(厚約5～6 μm)、染色、封片，光鏡下觀察肉芽組織、毛囊、血管的生成情況，評價創(chuàng)面愈合質(zhì)量。

1.5.4免疫熒光檢測巨噬細胞CD68的表達 參照1.5.3方法行常規(guī)脫水包埋后，PBS洗滌3次，熱抗原修復(fù)30 min,山羊血清(PBS稀釋)封閉30 min,滴加稀釋的CD68(1 ∶100)一抗4 ℃孵育過夜，洗滌3次，依次滴加熒光二抗和DAPI顯色劑，孵育30 min, 最后抗熒光衰減劑封片，熒光鏡觀察拍片，統(tǒng)計分析。

1.5.5Western blot法檢測VEGF、bFGF蛋白表達 經(jīng)研磨后總蛋白經(jīng)SDS-PAGE(10%)電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，滴加VEGF、bFGF一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，滴加二抗溫育2 h，曝光、顯影。Image J軟件對蛋白條帶結(jié)果進行光密度分析，內(nèi)參對照采用β-actin。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS 17.0軟件進行分析，采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠不同時間點肉眼觀察結(jié)果建模后第3天，模型組創(chuàng)口稍紅腫、少許滲液，邊緣皮膚開始褶皺。京萬紅組和PAE高、中、低各組創(chuàng)口干凈，創(chuàng)面被一層暗紅色新生薄皮覆蓋，創(chuàng)口邊緣皮膚收縮褶皺明顯。建模后第7天，模型組創(chuàng)面邊緣縮小不明顯，創(chuàng)面被一層暗紅色薄皮覆蓋未結(jié)痂。京萬紅組和PAE高、中、低各組創(chuàng)面收縮明顯，創(chuàng)面痂皮較厚并覆蓋整個創(chuàng)面。建模后第14天，模型組創(chuàng)口明顯縮小被肉芽組織填充。京萬紅組和PAE高、中、低各組創(chuàng)面痂皮脫落，被新生表皮覆蓋，瘢痕暗紅。見圖1。

2.2創(chuàng)面愈合率比較建模第0天各組創(chuàng)面面積比較，模型組(3.43±0.25) cm2、京萬紅組(3.57±0.29) cm2、PAE高(3.31±0.29) cm2、中(3.64±0.30) cm2、低(3.65±0.27) cm2組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.381，P>0.05)。見圖2。治療后第3、7天,京萬紅組和PAE高、中、低組的創(chuàng)面愈合率均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=11.064，P<0.05)，治療后第7天，PAE高中低組間比較， PAE中組愈合率高于PAE低組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=20.035，P<0.05)；第14天，與模型組比較，京萬紅組和PAE中組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.168，P<0.05)。見圖3、表1。

表1 創(chuàng)面愈合過程中各組創(chuàng)面愈合率的比較

與模型組比較：*P<0.05；與PAE中組比較：#P<0.05

2.3HE染色結(jié)果與模型組比較，光鏡結(jié)果顯示，治療后第3天，PAE中組可見新生毛細血管，成纖維細胞、汗腺細胞增生；治療后第7天，模型組炎細胞浸潤仍較明顯，成纖維細胞和新生血管數(shù)量較之前增多，PAE中組可見大量新生血管和成纖維細胞，少量炎細胞浸潤，上皮細胞增生明顯，密集汗腺細胞，導(dǎo)管內(nèi)徑增大；治療后第14天，模型組成纖維細胞增生明顯，肉芽組織形成，上皮細胞增生明顯，膠原纖維排列紊亂， PAE中組肉芽組織形成明顯，膠原纖維成縱行排列整齊，汗腺細胞和導(dǎo)管大量增生，排列整齊，毛囊較多。見圖4。

圖1 建模后各組創(chuàng)面愈合情況

圖2 各組皮膚創(chuàng)面初始面積比較

圖3 各組不同時間點大鼠皮膚創(chuàng)愈合率比較

2.4膠原纖維染色結(jié)果Masson染色結(jié)果見圖5～6，治療后第3天，與模型組比較，京萬紅組和 PAE中組膠原纖維增加更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=37.239，P<0.01)；治療后第7天，PAE高組和PAE低組均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=36.802，P<0.01)。PAE高中低組間比較，與PAE低組比較，PAE高組、PAE中組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=20.247，P<0.05)；第14天，與模型組比較，京萬紅組、PAE高組和PAE低組均減少，差異有統(tǒng)計意義(F=16.231，P<0.05)；PAE中組的膠原纖維明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=27.147，P<0.01)；PAE高中低組間比較， PAE中組均顯著少于PAE高組和PAE低組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.663，P<0.05)。

圖4 創(chuàng)傷后第3、7、14天各組HE染色圖 ×200

圖5 創(chuàng)傷后第3、7、14天各組膠原纖維染色圖 ×200

2.5創(chuàng)面肉芽組織中巨噬細胞的變化與模型組比較，第3、7天，京萬紅組和PAE高中低組中CD68陽性細胞數(shù)增加，PAE中組增加最明顯；第14天，京萬紅組和PAE高中低組的CD68陽性細胞數(shù)減少，PAE中組減少更明顯。見圖7。

2.6創(chuàng)傷愈合過程中VEGF、bFGF蛋白的表達變化

2.6.1VEGF蛋白表達變化 治療后第3天，與模型組比較，PAE 高組和PAE低組VEGF增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=11.150，P<0.05)；京萬紅組和PAE中組VEGF表達明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=13.681，P<0.01)；PAE高中低組之間比較， PAE中組VEGF均高于PAE高組和PAE低組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=18.520，P<0.05)。治療后第7天，京萬紅組和PAE中組高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=10.120，P<0.05)；PAE中組VEGF均高于PAE高組和PAE低組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=11.214，P<0.05)。第14天，PAE中組VEGF的表達量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.517，P<0.05)。見圖8。

2.6.2bFGF蛋白表達變化 治療后第3、7天，與模型組比較，京萬紅組和 PAE中組bFGF表達量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=22.353，P<0.05；F=9.960，P<0.05)；PAE各組之間比較，與PAE低組比較， PAE中組bFGF表達量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=36.461、12.660，P<0.05)；治療后第14天，與模型組比較，PAE中組bFGF表達減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.739，P<0.05)。見圖9。

圖6 創(chuàng)傷后第3、7、14天各組膠原纖維光密度值比較

與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01；與PAE高、低組比較：#P<0.05

圖7 創(chuàng)傷后第3、7、14天各組CD68陽性細胞數(shù)量比較 ×200

圖8 創(chuàng)傷后第3、7、14天各組VEGF光密度值比較

圖9 創(chuàng)傷后第3、7、14天各組bFGF光密度值比較

3 討論

創(chuàng)傷修復(fù)是指在外傷或疾病的過程中，造成組織缺損后局部組織通過增生或再生方式進行修補的一系列復(fù)雜的病理生理過程。通常，創(chuàng)傷愈合率、病理組織分析是直接而有效的創(chuàng)面愈合的評價指標(biāo)。通過觀察創(chuàng)面愈合率、HE染色結(jié)果和膠原纖維染色結(jié)果，證實PAE治療組創(chuàng)面修復(fù)的質(zhì)量和速率較模型組優(yōu)越，說明PAE能更好的促進創(chuàng)面修復(fù)。

CD68是巨噬細胞膜表面分子，是檢測巨噬細胞存在的標(biāo)志。Brochhausen et al[5]在實驗中闡明在創(chuàng)傷炎癥階段CD68高表達通過吞噬病原體和分泌多種酶降解細胞外基質(zhì)減輕炎癥反應(yīng)，在增殖階段，大量CD68分泌細胞生長因子和趨化因子誘導(dǎo)組織的增生。Venosa et al[6]在實驗中指出在增殖期肺損傷和修復(fù)與M2型(抗炎)巨噬細胞的積累有關(guān)，本實驗結(jié)果與之一致。說明在創(chuàng)傷早中期CD68的高表達可能與巨噬細胞分化成M1型：通過吞噬作用減輕創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)，同時也分化成M2型：分泌更多細胞因子促進肉芽組織生長有關(guān)，這點在牛軼雯 等[7]實驗結(jié)果中已證實，創(chuàng)傷后期CD68低表達可能通過信號通路抑制CD68分泌更多的細胞因子防止創(chuàng)面肉芽組織過度生長形成瘢痕疙瘩。

VEGF是高度特異性促進血管內(nèi)皮細胞生長因子，bFGF是來源于單核巨噬細胞或淋巴細胞的生長因子，卞明心 等[8]和Zhang et al[9]的實驗中明確指出在創(chuàng)傷修復(fù)的早中期階段通過刺激VEGF的表達促進新生毛細血管形成。Zhao et al[10]實驗中發(fā)現(xiàn)通過增加bFGF表達加速細胞增殖促進創(chuàng)傷愈合，Lin et al[11]實驗中發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)VEGF和MMPS蛋白的表達來抑制肺癌細胞的生長。Akasaka et al[12]發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷修復(fù)早期，細胞增殖超過細胞凋亡。因能促進肉芽組織形成，在創(chuàng)傷后期，細胞凋亡增加因使肉芽成長抑制,本實驗結(jié)果與之一致。創(chuàng)傷早中期， VEGF、bFGF蛋白的高表達可能使創(chuàng)面快速地從炎癥階段過度到肉芽組織增生階段，加速創(chuàng)面的成纖維細胞、毛細血管和細胞外基質(zhì)快速生長，創(chuàng)傷后期， VEGF、bFGF蛋白明顯下調(diào)，可能通過膠原纖維的合成與分解使膠原蛋白含量在新生的血管結(jié)締組織中達到相對平衡，有效減少創(chuàng)面瘢痕的形成。

綜上所述，PAE中組能更好地提高創(chuàng)面愈合速率，促進膠原沉積，毛細血管新生，成纖維細胞遷移和肉芽組織形成的作用，其藥理機制可能與創(chuàng)傷修復(fù)不同階段CD68分化和VEGF、bFGF表達有關(guān)，為進一步研究奠定基礎(chǔ)。