李靜 王立立 楊濤 溫麗 李曉紅 張倩倩 李燕

【摘要】目的 研究WT1基因甲基化狀態(tài)及其mRNA在多發(fā)性骨髓瘤患者血清中的表達情況。方法 選取2015年1月～2017年10月河北省中醫(yī)院收治的MM患者骨髓標本60例，運用熒光實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR檢測其mRNA表達水平。結(jié)果 60例多發(fā)性骨髓瘤患者存在WT1基因啟動子區(qū)甲基化，與對照組比較具差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論 WT1異常甲基化在MM的發(fā)病機制中具有一定作用，其可作為監(jiān)測多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病與治療反應的指標之一。

【關(guān)鍵詞】WT1；多發(fā)性骨髓瘤；甲基化

【中圖分類號】R733 【文獻標識碼】B 【文章編號】ISSN.2095-6681.2018.09..02

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是是常見的血液系統(tǒng)惡性疾病，以中老年患者居多。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，10%～15%AML患者存在WT1基因突變[1-2]。在探索多發(fā)性骨髓瘤患者中發(fā)病機制、異常免疫及靶向治療過程中，WT1的作用越來越受到重視，但其異常甲基化的狀態(tài)及其影響因素在MM中的作用目前仍不十分清楚，故本研究對MM中WT1甲基化及其表達進行了研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月～2017年10月河北省中醫(yī)院收治的MM患者骨髓標本60例，男32例，女28例，中位年齡68歲（52至79歲）。每例患者均行血常規(guī)、骨髓像分析、β-2微球蛋白、生化、免疫球蛋白、血尿免疫固定電泳、影像學檢查等，診斷標準參照國內(nèi)診斷標準，按1975年Durie-salmon分期系統(tǒng)進行分期，其中Ⅰ期15例，Ⅱ期20例，Ⅲ期25例。以同期就診的30例非惡性血液病患者（主要為缺鐵性貧血30例）為對照，缺鐵性貧血患者均經(jīng)詳細病史、血常規(guī)、貧血三項、血涂片等相關(guān)檢查確診。

1.2 研究方法

1.2.1 甲基化分析

使用人淋巴細胞分離液分離標本單個核細胞，提取DNA，進行PCR反應，CpG甲基轉(zhuǎn)移酶修飾陽性對照標本。

1.2.2 MSP產(chǎn)物測序

將MSP擴增產(chǎn)物50 μ送檢測序，測序結(jié)果運用DNA star軟件進行比對分析。

1.2.3 mRNA提取

使用TRI zol法提取單個核細胞總RNA，RNA小量制備試劑盒分離柱純化RNA，合成cDNA，進行定量PCR反應。

1.3 統(tǒng)計學方法

實驗所得數(shù)據(jù)利用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。甲基化分析采用x2檢驗，基因表達分析進行正態(tài)性檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 甲基化狀態(tài)

60例多發(fā)性骨髓瘤患者中檢出WT1基因啟動子區(qū)甲基化陽性率為21.66%（13/60）；30例對照組WT1基因甲基化陽性率為0.00%（0/30），二者對比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2 MSP產(chǎn)物測序結(jié)果

多發(fā)性骨髓瘤患者在WT1基因啟動子區(qū)MSP產(chǎn)物檢出19處堿基發(fā)生CT轉(zhuǎn)換。

2.3 mRNA表達結(jié)果

MM患者WT1mRNA表達情況：MM組：（12.39±18.32）Fold，對照組：（13.51±26.38）Fold，MM組與對照組之間比較，差異無統(tǒng)計意義（P>0.05）；甲基化組：（17.00±16.52）Fold，非甲基化組：（16.45±17.97）Fold；組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

3 討 論

多發(fā)性骨髓瘤是漿細胞惡性增殖性疾病，以分泌大量異常免疫球蛋白為主要特點，常表現(xiàn)為乏力、骨痛、病理性骨折、腎功能不全等，多發(fā)于老年人，為不可治愈性疾病。最早于2003年由Galm等報道了利用MSP技術(shù)檢測MM中WT1基因異常甲基化的情況，研究證實：35例骨髓瘤患者及U266和XGI骨髓細胞系列WT1啟動子區(qū)甲基化陽性率為65.71%（23/35），WT1基因異常甲基化能使得該基因沉默。但Melzner等采用Galm等提供的引物卻沒有得到預期結(jié)果。

WT1異常甲基化在MM的發(fā)病機制中具有一定作用，其可作為監(jiān)測多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病與治療反應的指標之一。WT1基因啟動子區(qū)甲基化表達在60例多發(fā)性骨髓瘤患者中陽性率為21.66%（13/60）；在30例對照組中甲基化陽性率為0.00%（0/30），陽性率低于國外報道，其原因可能為：本實驗研究對象多為復發(fā)患者。

參考文獻

[1] 肖 萌，何 娟，李 艷，等.BD方案與VAD方案治療多發(fā)性骨髓瘤的療效比較[J].中國醫(yī)科大學學報，2011，40（4）：352-356.

[2] 王金行，趙 越，劉柏新，等.血清免疫固定電泳在多發(fā)性骨髓瘤診斷中的意義[J].廣東醫(yī)學，2011，32（15）：2018-2020.

本文編輯：王雨辰