閆晨 王強 堵疾 王文姬

【摘要】目的：根據(jù)人纖維蛋白原臨床實驗要求，對使用了一定量的人纖維蛋白原制品的病人血清中人纖維蛋白原有無抗體進行測定。方法：參照中國合格評定國家認(rèn)可委員會CNAS-CL39等有關(guān)文件內(nèi)容要求，結(jié)合本實驗室的實際情況，制定了此方案。使用了上海雙贏生物科技有限公司生產(chǎn)的人纖維蛋白原抗體酶聯(lián)免疫分析定性試劑盒，對精密度、診斷敏感性、特異性、同一項目不同儀器的比對、CUTOFF值等各項參數(shù)在本實驗室探究性地進行研究。結(jié)論：1.精密度的試驗：3個樣品連續(xù)檢測10次后的CV分別為9.30%、14.1%、13.6%判斷標(biāo)準(zhǔn)：CV小于15%，2.特異性實驗：20份正常血清檢測結(jié)果計算符合率為100%。3.診斷敏感性的驗證：取10份已知真陽性的樣本用常規(guī)檢測方法檢測，計算檢測陽性的樣本占樣本總數(shù)的比例為100%。4.同一項目不同儀器的比對，MK3酶標(biāo)儀CV%：3.28%-9.84%。TECAN.SPECTRA酶標(biāo)儀CV%：2.82%-7.04%。5.CUTOFF值連續(xù)統(tǒng)計一段時間的檢測結(jié)果，處于臨界范圍的結(jié)果比為0（小于50%判為合格）。

【關(guān)鍵詞】人纖維蛋白原；抗體；臨床實驗；檢測

1 實驗原理

本試劑盒用雙抗原夾心法測定標(biāo)本中人纖維蛋白原抗體（FIB Ab）表達。用純化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，可與樣品中纖維蛋白原抗體（FIB Ab）相結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗原和其他成分后再與HIZP標(biāo)記的抗原結(jié)合，形成抗原一抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HIZP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），與CUTOFF值相比較，從而判定標(biāo)本中人纖維蛋白原抗體（FIB Ab）的存在與否。

2 項目測定

精密度（Precision），診斷敏感性（sensitivity of diagnosis）、特異性（specificity）、同一項目不同儀器的比對、CUTOFF值。

3 實驗內(nèi)容 （1）材料：人纖維蛋白原抗體（FIBAb）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（定性）；20份正常血清樣本；112份臨床使用了一定量的人纖維蛋白原制品的病人血清樣本；10份己知真陽性的樣本。使用儀器：用MK3酶標(biāo)儀（已校驗），TECAN.SPECTRA酶標(biāo)儀（已校驗）。 （2）試驗步驟：見人纖維蛋白原抗體（FIB Ab）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（定性）說明書。 （3）精密度的試驗：同一份樣本在同一批次內(nèi)平行重復(fù)檢測10次.然后計算CV。

（4）特異性實驗：20份正常血清檢測結(jié)果，計算符合率。

（5）診斷敏感性的驗證：取10份己知真陽性的樣本，計算符合率。

（6）同一項目不同儀器的比對。

（7）CUTOFF值：連續(xù)統(tǒng)計一段時間的檢測結(jié)果。

4 實驗步驟

人纖維蛋白原抗體（FIB AB）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書，本試劑盒僅供研究使用。 （1）編號：將樣品對應(yīng)微孔按序編號，每板應(yīng)設(shè)陰性對照2孔、陽性對照2孔、空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同） （2）加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50μl。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻， （3）溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

（4）配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

（5）洗滌：小L揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍千。

（6）加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

（7）溫育：操作同30

（8）洗滌：操作同50

（9）顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色巧分鐘.

（10）終止：每孔加終止液501，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

（11）測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

5 實驗結(jié)果

5.1 精密度的試驗

同一份樣本在同一批次內(nèi)平行重復(fù)檢測10次，然后計值，SD和CV.選取健康人血漿樣本3份（從正常人血清中隨機抽取），連續(xù)同一批次內(nèi)平行重復(fù)檢測10次，測得的結(jié)果如表2。

5.2 特異性實驗：20份正常血清檢測結(jié)果計算符合率

陰性對照平均值≤0.10。20份正常血清檢測OD值均≤0.10。結(jié)果均陰性，陰性符合率100%。如表3。

5.3 診斷敏感性的試驗

取10份己知真陽性的樣本（樣本來源困難時可以酌情減少）。用常規(guī)檢測方法檢測，計算檢測陽性的樣本占樣本總數(shù)的比例。

從20批已檢測的正常血清中任選10批，正常血清：陽性對照品=1：1的比例混勻，測得的結(jié)果見表3。10批陰性樣品的OD均值為0.018，臨界值為0.018+0.15=0.168.檢測結(jié)果均大于臨界值，故陽性的合格率為100%。

5.4 同一項目不同儀器的比對實驗，用CV表示

表4與表5為相同樣品同一時間不同型號酶標(biāo)儀的檢測結(jié)果。MK3酶標(biāo)儀CV%：3.28%～9.84%。TECAN.SPECTRA酶標(biāo)儀CV%：2.82%～7.04%。

5.5 CUTOFF值連續(xù)統(tǒng)計一段時間（共112個樣品）的檢測結(jié)果，處于臨界范圍的結(jié)果比例小于5%即可

對112個樣品進行檢測，平均每個樣品檢測三次所得CUTOFF均值為0.031。臨界值為0.031+0.15=0.181.對照檢測結(jié)果處于臨界范圍的結(jié)果比例為0。

6 實驗結(jié)果評價與分析

計算和結(jié)果判定：

試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00；陰性對照平均值≤0.10。

臨界值（CUT OFF）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15。

陰性判定：樣品OD值<臨界值（CUTOFF）者為纖維蛋白原抗體（FIB AB）陰性。

陽性判定：樣品OD值≥臨界值（CUTOFF）者為纖維蛋白原抗體（FIB AB）陽性。 （1）精密度的試驗：3個樣品連續(xù)檢測10次后的CV分別為9.3%，14.1%，13.6%判斷標(biāo)準(zhǔn)：CV小于15%， （2）特異性實驗：20份正常血清檢測結(jié)果計算符合率為100%。 （3）診斷敏感性的驗證：取10份己知真陽性的樣本用常規(guī)檢測方法檢測，計算檢測陽性的樣本占樣本總數(shù)的比例為100%。

（4）同一項目不同儀器的比對，MK3酶標(biāo)儀CV%：3.28%～9.84%o TECAN.SPECTRA酶標(biāo)儀CV%：2.82%～7.04%。

（5）CUTOFF值驗證連續(xù)統(tǒng)計一段時間的檢測結(jié)果，處于臨界范圍的結(jié)果比為0，小于5%。

7 標(biāo)本要求 （1）標(biāo)本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融 （2）不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。 （3）操作嚴(yán)格按照說明書進行，本試劑不同批號組分不得混用。

（4）試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

（5）濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。

（6）封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

（7）底物請避光保存。

（8）試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，使用雙波長檢測時，參考波長為630nm

（9）所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為2M的硫酸，使用時必須注意安全。