徐楊 韋力

【摘要】目的：探討小鼠放射性頜下腺損傷ICAM-1的表達變化，闡明放射誘導(dǎo)唾液腺損傷的可能機制。方法：將小鼠隨機分為對照組、放射組，放射組給予60Coγ射線一次性15Gy照射，對照組給予0Gy照射。照射后30d檢測小鼠唾液量，取小鼠頜下腺行Masson染色觀察膠原沉積情況、免疫組化觀察ICAM-1蛋白的表達。結(jié)果：與對照組相比，放射組小鼠唾液量明顯減少（P<0.05），膠原纖維沉積增多，ICAM-1蛋白表達明顯升高（P<0.05）。結(jié)論：放射誘導(dǎo)的唾液腺間質(zhì)纖維化機制可能與ICAM-1的表達升高有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】放射；頜下腺；ICAM-1

放射性唾液腺損傷是放射治療頭頸部惡性腫瘤的常見并發(fā)癥之一。據(jù)統(tǒng)計，大約70%的患者在接受頭頸部放療后會出現(xiàn)不同程度的放射性口腔干燥癥，給患者生活造成極大困擾m臨床上表現(xiàn)為口腔灼痛感，味覺異常，吞咽和說話困難以及食欲不振，并增加齲齒和口腔感染的風(fēng)險，不僅影響患者生活質(zhì)量，甚至可能會導(dǎo)致患者中斷放療。

關(guān)于放射性口腔干燥癥的機制，雖然國內(nèi)外學(xué)者從多方面進行了大量的研討，但尚未有定論。因此，探討放射性唾液腺損傷的機制，對于尋找有效防治措施減少放射性口腔干燥癥的發(fā)生，提高患者生活質(zhì)量至關(guān)重要。

研究表明，照射后唾液腺早期的炎性反應(yīng)是其功能受損的重要原因，而晚期功能出現(xiàn)不可逆損傷的重要機制之一是腺體間質(zhì)纖維化[2]。細胞間黏附分子-1（Intercellular Adhesion Molecule-1，ICAM-1）是體內(nèi)重要的黏附分子之一，參與多種病理生理過程，在放射性肺損傷、腦損傷等多種放射導(dǎo)致的急慢性損傷中起重要作用，不僅能介導(dǎo)早期炎性反應(yīng)，而且與晚期間質(zhì)纖維化密切相關(guān)[3，4]。

本實驗旨在探討放射后小鼠頜下腺ICAM-1的表達變化，闡明放射后唾液腺功能不可逆損傷的可能機制，為防治放射性口腔干燥癥提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

體重30-34g的雌性昆明小鼠（廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供）12只隨機分為對照組和放射組兩組，每組6只。

1.2 主要試劑和儀器

6oCo照射源（廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院），毛果蕓香堿、改良Masson三色染色液（北京索萊寶科技有限公司），石蠟切片機、光學(xué)顯微鏡（德國leica公司），ICAM-1抗體（美國Abeam公司）。

1.3 照射方法

小鼠經(jīng)3.5%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉后，置于60Coγ治療機平臺，使頸部充分暴露于射線下，其它部位受鉛板保護避免照射。放射組給予60Coγ射線一次性15Gy照射，對照組照射劑量0。

1.4 唾液量的測定

照射后30d檢測小鼠唾液量：準(zhǔn)備數(shù)個小棉球，稱重記為總干重，小鼠麻醉后皮下注射毛果蕓香堿（2mg/kg），將小棉球放入小鼠舌下，隨時更換。30min后稱量棉球重量記為總濕重。唾液分泌量一總濕重-總干重。按照1g/ml計算唾液體積。

1.5 頜下腺樣本的采集

分離取出小鼠頜下腺放入4%中性甲醛中固定，24h后脫水、透明、浸蠟、包埋、切片。切片厚度4μm。

1.6 Masson染色

切片脫蠟至水，入Bouin液，于37℃的溫箱內(nèi)2h進行媒染。水洗后天青石藍滴染2min，水洗后Mayer蘇木素滴染2min。水洗后酸性乙醇分化液分化數(shù)秒，流水沖洗10min。麗春紅品滴染10min。水洗后磷鉬酸溶液處理10min。傾去上液，滴入苯胺藍染色液染5min。常規(guī)脫水、透明、封片。

1.7 免疫組化法檢測小鼠頜下腺ICAM-1蛋白的表達

切片脫蠟至水，高壓修復(fù)，3%HZOZ孵育10min，血清封閉15min，甩去多余液體滴加一抗ICAIM-1（稀釋比1：2000），4℃過夜。次日復(fù)溫50min，滴加二抗，室溫孵育30min；DAB顯色。復(fù)染，蘇木精染色2min，分化液分化，常規(guī)脫水、透明、封片。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

將免疫組織化學(xué)切片置于顯微鏡下觀察，每張切片隨機選取5個視野拍照，采用Image Pro Plus圖像分析軟件對ICAM-1蛋白的表達進行分析，實驗數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，均數(shù)的比較采用獨立樣本t檢驗，數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 唾液量測定

由表1可知，在放射后30d，與對照組相比，放射組小鼠唾液量明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 Masson染色結(jié)果

膠原纖維主要沉積在血管及導(dǎo)管周圍，如圖1所示，對照組僅有少量沉積，而放射組可觀察到大量膠原纖維沉積于血管及導(dǎo)管周圍，說明放射組腺體內(nèi)出現(xiàn)間質(zhì)纖維化。

2.3 小鼠頜下腺ICAM-1蛋白的表達

顯微鏡下免疫組化染色觀察，由表2和圖2可見：ICAM-1陽性表達主要位于血管內(nèi)皮、各級導(dǎo)管上皮細胞的包膜和胞質(zhì)內(nèi)。對照組可見少量表達，與對照組相比，放射組陽性表達明顯增強，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

臨床上發(fā)現(xiàn)，接受頭頸部放療的患者因為唾液腺受到不同程度的損傷導(dǎo)致唾液分泌減少，造成放射性口腔干燥癥，嚴重影響放療后患者的生活質(zhì)量。

在本實驗中，通過檢測小鼠唾液量，發(fā)現(xiàn)放射組小鼠唾液量明顯減少，這說明實驗造模是成功的。通過Masson染色顯示，放射組小鼠頜下腺血管及導(dǎo)管周圍出現(xiàn)大量膠原纖維沉積，說明放射后的腺體出現(xiàn)了間質(zhì)纖維化，與既往研究相符[5]。

ICAM-1作為一種重要的黏附分子被認為是導(dǎo)致放射后急性期炎癥和后期纖維化的重要因子。它主要在免疫細胞和血管內(nèi)皮細胞上表達，可以誘導(dǎo)白細胞向受損組織中遷移[6]。體外培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細胞，發(fā)現(xiàn)照射后ICAM-1表達持續(xù)增加[7]。此外，ICAM-1也被證明是輻射誘導(dǎo)的肺內(nèi)皮組織中炎性細胞遷移的必需條件，并具有刺激纖維化因子分泌的功能，參與放療后的肺纖維化過程[8]。

ICAM-1在唾液腺血管內(nèi)皮和導(dǎo)管上皮細胞均有所表達，Saito I等證明ICAM-1在舍格倫綜合征中參與誘導(dǎo)淋巴細胞浸潤[9]。Kapsogeorgou EK等對舍格倫綜合征患者的唾液腺活檢中也發(fā)現(xiàn)31%的導(dǎo)管上皮ICAM-1表達強烈，并通過體外實驗表明唾液腺上皮ICAM-1的高表達可能在發(fā)病機制中起重要作用[10]。

ICAM-1在放射性唾液損傷的表達變化及其是否發(fā)揮作用尚未見報道。我們推斷ICAM-1在放射誘導(dǎo)的唾液腺間質(zhì)纖維化的過程中起重要作用，是放射性口腔干燥癥的機制之一。在本實驗中，通過免疫組化染色觀察和統(tǒng)計，結(jié)果顯示，與對照組相比，放射組小鼠頜下腺中ICAM-1蛋白表達明顯增加。

綜述所述，放射后唾液腺ICAM-1蛋白表達增加可能是導(dǎo)致腺體內(nèi)膠原纖維沉積增加，促進腺體纖維化，加重唾液腺損傷程度，使唾液分泌減少的重要原因。抑制放射后ICAM-1的表達可能是防治放射性口腔干燥癥的有效措施。

參考文獻

[1]Mossman K，Shatzman A，ChencharickJ.Long-term effects ofradiotherapy on taste and salivaryfunction in man[J].Int I RadiatOncol Biol Phys，1982，8（06）：991-997.

[2]Kamiya M，Kawase T，Hayama K，etal.X-Ray-Induced Damage to theSubmandibular Salivary Glandsin Mice：An Analysis of Strain-Specific Responses[J].Biores OpenAccess，2015，4（01）：307-318.

[3]張振勇，曹秋婷，吳榮.放射性肺損傷中核因子κB和細胞間黏附分子1的表達及意義[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014（02）：155-158.

[4]楊靜，趙博，張雪寧.放射性腦損傷大鼠腦組織細胞間黏附分子-1表達觀察[J].山東醫(yī)藥，2017（07）：40-42.

[5]Xu L，Yang X，Chen J，et al.Simvastatin attenuates radiation-induced salivary gland dysfunctionin mice[J].Drug Des DevelTher，2016，10：2271-2278.

[6]Kishimoto T K，RoTh1einR.Integrins，ICAMs，andselectins：role and regulationof adhesion molecules inneutrophil recruitment toinflammatory sites[J].AdvPharmacol，1994，25：117-169.

[7]Gaugler M H，Squiban C，vander Meeren A，et al.Late andpersistent up-regulation ofintercellular adhesion molecule-1（ICAM-1）expression by ionizingradiation in human endothelialcells in vitro[J].Int I RadiatBiol，1997，72（02）：201-209.

[8]Hallahan D B，VirudachalamS.Intercellular adhesionmolecule 1 knockout abrogatesradiation induced pulmonaryinflammation[J].Proc Natl AcadSci U S A，1997，94（12）：6432-6437.

[9]Saito I，Terauchi K，ShimutaM，et al.Expression of celladhesion molecules in thesalivary and lacrimal glands ofSjogren's syndrome [J].J Clin LabAnal，1993，7（03）：180-187.

[10]Kapsogeorgou E K，Dim itriou ID，Abu-Helu R F，et al.Activationof epithelial and myoepithelialcells in the salivary glandsof patients with Sjogren'ssyndrome：high expression ofintercellular adhesion molecule-1（ICAM.1）in biopsy specimensand cultured cells[J].Clin ExpImmunol，2001，124（01）：126-133.