王紅紅 潘云 李艷
【摘要】目的:構(gòu)建針對人NSD2基因的shRNA慢病毒載體,并觀察其在人腎293T細胞中沉默效果,從而為進一步研究NSD2基因在其他腫瘤細胞系中的表達及影響莫定基礎(chǔ)。方法:以NSD2基因為靶標(biāo),設(shè)計并合成2條互補寡核苷酸序列(NSD2 shRNA-1,NSD2 shRNA-2)克隆至PLKO-βuro重組慢病毒載體中,形成新的重組慢病毒載體PLKO- NSD2-puroe然后與包裝質(zhì)粒PMDL、PV5VG、PREV在 293T細胞中進行包裝,產(chǎn)生重組慢病毒顆粒,并進一步感染293T細胞,通過提取蛋白進行Western Blot檢測NSD2基因沉默效果。結(jié)果:通過PCR鑒定和DNA測序鑒定證明NSD2 shRNA-1,NSD2 shRNA-2重組shRNA慢病毒表達質(zhì)粒中插入了目的DNA片段。且通過Western Blot檢測NSD2基因沉默效果,證明了NSD2 shRNA構(gòu)建效果不錯,可以進一步運用于與NSD2相關(guān)的腫瘤細胞細胞系中。結(jié)論:成功構(gòu)建了人的NSD2基因shRNA真核表達的慢病毒載體,為進一步應(yīng)用于其他與NSD2相關(guān)的癌細胞系,針對NSD2基因的腫瘤治療研究莫定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】NSD2:shRNA:慢病毒:載體構(gòu)建:293T細胞
NSD2又稱MMSET(multiple myelomaSET domain)或者WHSC1(Wolf- Hirschhorn syndrome candidate 1),位于染色體4p16.3上,是NSD蛋白家族的重要成員之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)NSD2基因的表達水平與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。比如,最初發(fā)現(xiàn)的因NSD2單倍體計量不足導(dǎo)致的以腦部發(fā)育過小和智力發(fā)育遲緩為特點的沃爾夫綜合征(Wolf Hirschhornsyndrome)[2]。研究顯示NSD2在多類腫瘤中存在高表達,且與多種腫瘤的發(fā)生及惡性程度有關(guān)[3]如:淋巴系統(tǒng)腫瘤[4],骨肉瘤[5],乳腺癌,胰腺癌等。且研究顯示NSD2在神經(jīng)母細胞瘤[6],結(jié)腸癌,肺癌等多種腫瘤中存在過表達[1],提示NSD2有潛在的致瘤作用,表明NSD2可作為相關(guān)腫瘤診斷的理想標(biāo)志物[1,7]且NSD2的致癌作用首先在MM(Mutiple Myeloma,多發(fā)性骨髓瘤)中證實的[8],t(4;14)(p16;q32)易位是MM中最常見的易位之一,與MM的不良預(yù)后有直接關(guān)系[8,9]。多項研究報道,NSD2的過表達在有t(4;14)(p16;q32)易位的MM病例中普遍存在,并成為這種亞型MM的一個關(guān)鍵致癌因素[10]。shRNA(shorthairpin RNA)的發(fā)現(xiàn),已成為特異性抑制基因快捷高效表達的一種技術(shù)手段。且近年來慢病毒載體表達的shRNA介導(dǎo)的基因沉默被廣泛應(yīng)用于基因研究,藥物靶點的篩選等。因此為更好的研究NSD2蛋白在基因區(qū)分部特點,以及NSD2基因與其他基因的相關(guān)性,進一步分析NSD2的轉(zhuǎn)錄活性,本研究從shRNA入手,構(gòu)建了針對NSD2基因的shRNA慢病毒干擾載體,并將該基因的沉默作用侵染到293T細胞中,并為進一步分析NSD2基因在其他腫瘤細胞系中的表達機制提供基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1 實驗材料
人腎293T細胞株,TRC2-βLKO-βuro慢病毒表達載體質(zhì)粒,大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞,慢病毒包裝質(zhì)粒PMDL.PV5VG、PREV全都由中國科學(xué)院生物物理研究所李國紅研究員實驗室饋贈。
1.2 方法
1.2.1 人NSD2基因靶向shRNA序列的設(shè)計與合成
在NCBI網(wǎng)Gene數(shù)據(jù)庫搜索得到人NSD2基因mRNA序列(Gene ID:NM-001042424.2-CCDS33940.1)的轉(zhuǎn)錄本,PCR引物設(shè)計按照shRNA的設(shè)計原則,參照人NSD2基因序列完整的轉(zhuǎn)錄本1(NM-001042424.2),再根據(jù)TRC2-βLKO-βuro載體的特點(圖1)。酶切位點為Kpn1與ECOR1,設(shè)計合成2對shRNA單鏈寡核苷酸片段(表1)。將設(shè)計的引物發(fā)送至上海生工生物有限公司合成,得到干粉oligoDNA,先用ddH2O配置成100uM的溶液。然后引物退火:shRNA#1/2 F/R(100um)各取10ul,5XGC buffer 8ul,ddH2O 12ul共40ul,
沸水(100℃)域煮5min后,用一個燒杯連同引物加水一塊取出,室溫下使引物自然冷卻,即可形成雙鏈的shDNA。
1.2.2 NSD2-shDNA片段與PLKO-βuro表達載體的構(gòu)建
將TRC2-βLKO-βuro載體分別用Kpn1與ECOR1進行雙酶切,體系為TRC2-PLKO-βuro載體質(zhì)粒3ug,限制性內(nèi)切酶Kpn1與ECOR1分別1ul,10X buffer 3ul,ddH20補足至30ul。然后將NSD2-sbDNA片段與PLKO-βuro表達載體連接。連接體系:T4酶0.5ul,載體V(PLKO)0.5ul,10XT4 buffer 2ul,Insert(退火后引物稀釋10倍用)1ul,ddH2O 16ul共20ul。16℃連接過夜。
1.2.3 重組NSD2-shRNA干擾表達質(zhì)粒的鑒定
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a。取80ul混勻的菌液,均勻涂布于含Amp+100ug/ml的LB固體培養(yǎng)基中,37度培養(yǎng)過夜至長菌。然后隨機挑取3個單克隆菌落,分別接種于4ml含50ug/ml的氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中,恒溫37℃搖床,200rpm/min震蕩搖過夜。次日用生工小提中量質(zhì)粒提取試劑盒提質(zhì)粒,并送北京美吉生物測序。測序引物為人的U6通用引物。測序結(jié)果與引物序列比對,比對結(jié)果(如圖2)。
1.2.4 病毒侵染建立穩(wěn)定細胞系
1.2.4.1 慢病毒包裝 (1)當(dāng)293T細胞生長密度至細胞基區(qū)的65-70%時,開始轉(zhuǎn)染細胞。 (2)取1.77ug shRNA載體質(zhì)粒、1.152ugpMDL質(zhì)粒、0.62ugpVSVG質(zhì)粒和0.469ug pREV質(zhì)粒到一個新的1.5ml無菌EP管中與DMEM共250ul混合均勻,另一管lout的biotool溶液與DMEM共250ul混合均勻,室溫放置5min后,將上述的兩管溶液在室溫下混合均勻,在室溫靜置20min。全部轉(zhuǎn)移至待轉(zhuǎn)染細胞的細胞培養(yǎng)皿中混勻,將細胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 (3)轉(zhuǎn)染6-7小時后,用新鮮培養(yǎng)基,給已轉(zhuǎn)染的細胞換液并繼續(xù)培養(yǎng)。
(4)轉(zhuǎn)染48小時后將含有病毒顆粒的細胞培養(yǎng)基上清液轉(zhuǎn)移至新的15ml無菌離心管,再在細胞培養(yǎng)皿中加入3ml新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
(5)24h后再次收取細胞培養(yǎng)基上清,與前次收取的含有病毒顆粒的細胞培養(yǎng)基合并,室溫下2000rpm,離心5min,用濾器過濾上清液到新無菌管中。
1.2.4.2 用慢病毒侵染細胞 (1)將待侵染的細胞傳代至3.5cm細胞培養(yǎng)皿中,當(dāng)細胞貼壁時,吸棄細胞培養(yǎng)基。并將病毒懸液滴加在細胞表面,加入0.5ul 10mg/ml polybrene后混勻,37℃恒溫箱培養(yǎng)。 (2)侵染8小時后吸棄細胞培養(yǎng)皿中的液體,加入2ml新鮮的細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。 (3)在細胞生長為80%,將細胞傳代至6cm細胞培養(yǎng)皿。細胞生長到80%細胞培養(yǎng)皿時,繼續(xù)傳代。
(4)24小時后,用加相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基換液,大約7天后,存活下來的即為被慢病毒成功侵染的細胞。
1.2.5 Western Blot檢測NSD2基因沉默是否構(gòu)建成功。
培養(yǎng)72h后收細胞。用500ul的RIPI裂解液(50mMTris:150mM Nael,0.5%TrionX-100;0.1 %DOC,1mMEDTA)同時加入蛋白酶抑制劑終濃度為(1mM PMSF,1000Xleupeptin,1000X Aprotinin)水浴超聲裂解細胞提取蛋白。加5XSDS loading終濃度為2X,100℃煮樣15min。Westem Blot檢測,先將蛋白定量,10% SDS-βAGE電泳跑膠,濕轉(zhuǎn)(360mA,90min)轉(zhuǎn)移至NC膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1小時。敷一抗(NSD2 ab75359 1:1000;Tubulin 1:5000),4℃孵育過夜,用1:10000的HRP標(biāo)記的抗鼠二抗室溫孵育1小時。洗膜TBST洗5次/7mino化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。
2 結(jié)果與分析
2.1 NSD2-shDNA片段與PLKO-βuro表達載體的構(gòu)建鑒定
針對NSD2構(gòu)建的2種shRNA-NSD2-PLKO-βuro表達載體經(jīng)測序驗證,結(jié)果表明插入的核苷酸序列完全正確無突變堿基(圖2),證實成功構(gòu)建2個針對NSD2基因的shRNA干擾表達載體。將兩個質(zhì)粒分別命名為shRNA-NSD2-βLKO-1和TshRNA-NSD2-βLKO-2。
2.2 Western Blot檢測逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的人NSD2基因沉默效果
將shRNA-NSD2-βLKO-1與shRNA-NSD2-βLKO-2干擾質(zhì)粒通過慢病毒侵染后建立穩(wěn)定細胞系,以未轉(zhuǎn)染的293T細胞,以及shRNA-NSD2-βLKO-1與shRNA-NSD2-βLKO-2瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞的樣品作為對照組。Western Blot結(jié)果顯示瞬時轉(zhuǎn)染的NSD2表達抑制有所下降,通過慢病毒侵染建立穩(wěn)定細胞系的NSD2表達基本全部沉默。圖3。
3 討論
NSD2(MMSET或WHSC1)是一類組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶,能催化H3第36位發(fā)生二甲基化(H3K36rne2)[11],在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[5,12]。研究表明NSD2的高表達對基因的影響可能涉及:P53通路;NF-KB通路;整合素通路;細胞周期調(diào)控機制;c-MYc的表達等[7,13,14]。并且NSD2與淋巴系統(tǒng)腫瘤等多種腫瘤中都存在表達的異常,與腫瘤的發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。因此研究NSD2在基因區(qū)的表達水平,對探究腫瘤的特異性靶點以及相關(guān)抑制劑的研究具有重要臨床意義。
NSD2作為重要的組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶,在國內(nèi)研究還比較少。因此為進一步闡明人NSD2基因的功能及表達,本研究成功構(gòu)建了2個人NSD2基因的shRNA干擾表達載體shRNA-NSD2-βLKO-puro。通過Western Blot檢測慢病毒侵染的人NSD2基因沉默效果表明,對照組NSD2蛋白的表達與shRNA-NSD2-βLKO-Puro慢病毒侵染的NSD2蛋白表達水平有顯著差異。表明構(gòu)建的2個shRNA真核表達載體能有效抑制293T細胞中NSD2的表達。表明其下調(diào)人NSD2基因表達。其中以慢病毒侵染的shRNA NSD2沉默效果最佳??傊?,本研究成功構(gòu)建了2個針對人NSD2基因的shRNA干擾表達載體,可顯著降低293T細胞中 NSD2基因的表達,為進一步研究NSD2基因在其他癌細胞系中的表達及影響機制奠定了基礎(chǔ)。
參考文獻
[1]Theodore Vougiouklakisl,R.H.,Yusuke,Nakamural&Vassiliki;,Saloura*,1,TheNSD family of proteinmethyltransferases in humancancer.Future Medicine,2015.
[2]Toyokawa,G.,et al.,Histone LysineMethyltransferase Wolf-HirschhornSyndrome Candidate 1 Is Involvedin Human Carcinogenesis throughRegulation of the Wnt Pathway.Neoplasia,2011,13(10):p.887-IN11.
[3]Peri,S.,et al.,NSD1-and NSD2-damaging mutations define asubset of laryngeal tumors withfavorable prognosis.Nat Commun,2017,8(O1):p.1772.
[4]Iaffe,I.D.,et al.,Globalchromatin profiling reveals NSD2mutations in pediatric acutelymphoblastic leukemia.Nat Genet,2013,45(11):p.1386-91.
[5]Lu MH,F(xiàn).M.,Yu XD.,NSD2 promotesosteosarcoma cell proliferationand metastasis by inhibitingE-cadherin expression.2017.
[6]Hudlebusch,H.R.,et al.,MMSETis highly expressed andassociated with aggressivenessin neuroblastoma.CancerRes,2011,71(12):p.4226-35.
[7]Wu,Z.,I.Connolly,and K.K.Biggar,Beyond histones一theexpanding roles of proteinlysine methylation.FEBSJ,2017,284(17):p.2732-2744.
[8]Stec I,Wright TJ,van Ommen GJ,e.a.,WHSC1,a 90 kb SET domain-containing gene,expressed inearly development and homo10gousto a Drosophila dysmorphy genemaps in the Wolf-Hirschhornsyndrome cri tical region andis fused to IgH in t(4:14)multiple myeloma.Hum Mol Genet.1998:7(07):1071-1082.,1998.
[9]Huang,Z.,et al.,NSD2 isrecruited through its PHD domainto oncogenic gene loci todrive multiple myeloma.CancerRes,2013,73(20):p.6277-88.
[10]Xie,Z.,et al.,MMSETregulates expression ofIRF4 in t(4:14)myeloma andits silencing potentiatesthe effect of bortezomib.Leukemia,2015,29(12):p.2347-54.
[11]Yamada-Okabe,T.,et al.,F(xiàn)unctional characterizationof the zebrafish WHSC1-relatedgene,a homo10g of human NSD2.Biochem Biophys Res Commun,2010,402(02):p.335-9.
[12]Shah,M.Y.,et al.,MMSET/WHSC1enhances DNA damage repair leadingto an increase in resistance tochemotherapeutic agents.Oncogene,2016,35(45):p.5905-5915.
[13]Yang,P.,et al.,HistoneMethyltransferase NSD2/MMSETMediates Constitutive NF-BSignaling for Cancer CellProliferation,Survival,and TumorGrowth via a Feed-Forward Loop.Molecular and Cellular Bio10gy,2012,32(15):p.3121-3131.
[14]Hamamoto,R.,V.Saloura,and Y.Nakamura,Critical roles of non-histone protein lysine methylationin human tumorigenesis.Nat RevCancer,2015,15(02):p.110-24.