范芳芳，陳舒曼，楊洪軍，張 藝，唐仕歡，李德風，張 毅，張晶晶，高金環(huán)

(1.中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700；2.成都中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學院，成都 611137)

腦卒中是嚴重影響人類生活健康的腦血管疾病，具有高致死、高致殘率、高復發(fā)率等特性?！吨袊难懿蟾?016》推算，腦卒中現(xiàn)患病人數(shù)1 300萬，占中國心血管病中病種人數(shù)比例首位[1]。其中以缺血性腦卒中為主，腦缺血是由于腦部血液供應障礙導致的腦血管疾病，腦缺血后血流恢復導致的腦組織損傷和功能障礙加重，即腦缺血性再灌注損傷。目前尚無根治腦缺血再灌注損傷的藥物，但隨著中西醫(yī)結合思想的發(fā)展，中西藥結合治療腦血管疾病也取得較好的效果。

谷紅注射液(Guhong injection,GH)是由乙酰谷酰胺與紅花提取液組成的中西藥聯(lián)用復方制劑典型代表，主要用于增加腦保護、抵抗慢性缺氧、改善認知功能，但目前在減輕腦缺血損傷方面作用物質(zhì)基礎以及分子作用機制尚不明確[2-7]。本研究采用常用的大鼠大腦中動脈栓塞-再灌注模型，對谷紅注射液治療腦缺血再灌注損傷的藥效作用進行考察；在有效性基礎上，結合網(wǎng)絡藥理學技術，對其藥效物質(zhì)基礎及分子作用機制進行網(wǎng)絡預測，為谷紅注射液進一步深入研究提供理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF級健康SD大鼠30只，雄性，體重：280±10 g，由北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限責任公司提供，合格證號：SCXK(京)2014-0004。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院基礎研究所動物實驗中心，室溫22～25℃，濕度55%，通風良好，自由進水飲食。將大鼠隨機分為假手術組(Sham)、模型組(Vehicle)、金納多組(Ginaton)、谷中注射液低劑量組(GH-L)、谷紅注射液高劑量組(GH-H)，每組6只。

1.2 試劑與儀器

谷紅注射液(生產(chǎn)批號：20170402，通化谷紅制藥有限公司提供)；金納多注射液(生產(chǎn)批號：KC068，中豪國際有限公司)；魚線線栓購自北京西濃科技有限公司；戊巴比妥鈉(merck：P11011)、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-trephenyltetrazolium chloride，TTC，Lot# BCBR5462，)購自美國Sigma公司；4%多聚甲醛購自北京索來寶生物科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 模型建立

健康大鼠適應3天后，觀察狀態(tài)正常，開始造模，采用1%戊巴比妥鈉腹腔注射(50 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，頸部剃毛消毒后固定于平板上，經(jīng)頸正中切口，鈍性分離皮下組織和肌肉，暴露出頸總動脈和頸外動脈。小心分離頸外動脈和頸內(nèi)動脈，并用手術線將頸總動脈近心端和頸內(nèi)動脈遠心端結扎，阻斷血流供應，頸外動脈近心端靠近動脈分叉處穿手術線打一松結，以防插線時切口處滲血，電凝器凝斷遠心端頸外動脈，用顯微剪在頸外動脈剪一小口，插入直徑為0.26 mm的線栓，縫合線稍扎緊后，松開頸內(nèi)動脈上結扎線，將其緩慢插入頸內(nèi)動脈，阻力明顯時停止插栓，一般可插入長度18～20 mm后，松開頸總動脈近心端結扎線，觀察無異常后，縫合傷口。90 min后根據(jù)情況再次麻醉大鼠，輕輕拔出線栓。假手術組操作步驟相同，不插入線栓。

2.2 給藥

造模90min后拔栓即刻腹腔注射給藥，24 h后再給藥1次，Ginaton組給予Ginaton注射液0.8 mL·100 g-1，GH-L組給予谷中注射液0.062 5 mL·100 g-1，GH-H組給予谷紅注射液高劑量0.25 mL·100 g-1,手術48小時后取材。

2.3 藥效學評價指標

Longa 5分評分法：根據(jù)大鼠神經(jīng)功能損傷不同該評分分6個等級：正常，無神經(jīng)功能缺損，0分；左側前爪不能完全伸展，輕度神經(jīng)功能缺損，1分；行走時，大鼠向癱瘓側轉(zhuǎn)圈，中度神經(jīng)功能缺損，2分；行走時，大鼠身體向癱瘓側傾倒，3分；重度神經(jīng)功能缺損，不能自發(fā)行走，有意識喪失，4分；死亡，5分。分別對5個組別大鼠進行評分，記錄。

TTC染色及腦梗死面積計算：1)大鼠稱重后，1%戊巴比妥鈉麻醉，斷頭取腦，生理鹽水沖洗鼠腦，將腦放入腦模具內(nèi)，依視交叉為基準，遠心端切2片，近心端切4片，共切6片，每片2 mm，放入裝有1% TTC染液的六孔板中，避光37 ℃下染色20 min，待顏色變成玫紅色，回收TTC，加入4%多聚甲醛固定組織2 h，取出在白色背景下正反面拍照。2)腦梗死面積計算：應用Image J計算機圖像分析軟件統(tǒng)計腦片正反面白色梗死灶及整個腦片面積。以6片腦片正反白色梗死區(qū)域總面積與6片完整腦片正反總面積的百分比為腦梗死率計算，統(tǒng)計各組梗死率。

2.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0軟件，進行實驗數(shù)據(jù)的單因素方差分析，以P<0.05為顯著性水平。

3 網(wǎng)絡藥理學分析方法

3.1 化學成分庫建立

根據(jù)查閱文獻[8-12]、TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://ibts.hkbu.edu. hk/LSP/tcmsp.php)、TCMIP數(shù)據(jù)庫(http://www.tcmip.cn/)、TCMID(http://www. megabionet.org/tcmid/search/)數(shù)據(jù)庫等平臺搜集紅花化學成分188個，由于乙酰谷酰胺為西藥，且其主要是透過血腦屏障分解為γ-氨基丁酸和谷氨酸以發(fā)揮改善腦部功能作用，故乙酰谷酰胺按3個成分計。谷紅注射液共收集得成分191個，均通過PubChem數(shù)據(jù)庫搜集得其InChI結構，構建谷紅注射液化學成分數(shù)據(jù)庫。

3.2 靶點預測與功能富集

將所得谷紅注射液成分InChI結構導入BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫，以成分靶標預測評分≥15且P-value<0.05作為篩選指標進行谷紅注射液靶標預測和作用通路等功能富集，下載相應的結果文件。

3.3 核心作用靶標與“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡構建

分別篩選出谷紅注射液KEGG通路富集中P-value值小于0.05的通路，再經(jīng)過文獻查閱[13-18]篩選出與腦缺血再灌注損傷相關通路，找到谷紅注射液作用通路12條，相關作用靶標748個。將共有靶標導入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl?UserId=E1Q8IT dPQFCh&sessionId=wby 686rpsVie&input_page_show_search=on)，構建潛在靶標的相互作用網(wǎng)絡，靶標之間相互作用以可信度大于0.9構建蛋白相互作用關系，下載結果文檔。根據(jù)BATMAN-TCM“成分-靶標”結果從中篩選可能作用于核心靶標的化學成分。最后應用Cytoscape軟件構建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡作用圖，并應用Cytoscape中apps項下Centiscape2.2進行Degree、Betweeness、Closeness值進行分析，再根據(jù)apps項下MCODE進行核心網(wǎng)絡分析，獲取核心作用靶標。

圖1 Longa 5神經(jīng)學檢查評分結果(與模型組相比，GH-H組與Ginaton組均具有顯著性差異，P<0.05)Fig.1 Longa 5 neurological scores (Compared with the model group, there was significant difference in GH-H group and Ginaton group, P<0.05)

4 結果

4.1 Longa 5分評分結果

根據(jù)Longa 5分神經(jīng)功能評分法結果，與Sham組相比，Vehicle組分值顯著升高；與Vehicle組相比較，GH-L組、GH-H組與Ginaton組分值均降低，GH-H組與Ginaton組效果相近，見圖1，表明谷紅注射液與金納多效果相當，都具有良好的改善腦缺血再灌注損傷作用。

4.2 TTC染色及腦梗死率結果

TTC染色結果顯示(見圖2a)，Sham組無白色梗死帶，模型組與Sham組相比，可見明顯的梗死面積；與模型組相比，GH給藥組梗死面積相對減少，GH-H效果顯著(P<0.05)，Ginaton梗死率較低，效果顯著(P<0.05)；結合腦梗死面積率統(tǒng)計結果(見圖2b)表明，谷紅注射液對于腦缺血再灌注具有良好的保護作用。

與模型組相比，GH-H組與Ginaton組均具有顯著性差異，P<0.05圖2 TTC染色結果及梗死率結果Fig.2 The results of TTC staining and infarct rate

4.3 功能及通路富集分析

根據(jù)本研究建立的谷紅注射液化學成分庫，基于BATMAN-TCM平臺分析，得到相應的藥物靶標及功能通路分析結果。根據(jù)文獻篩選出與腦缺血再灌注損傷相關功能通路[13-18]，篩選出谷紅注射液通路12條，見下表1?？梢姽燃t注射液主要通過以下Amino acid metabolism、Calcium signaling pathway、Neuroactive ligand-receptor interaction、Lipid metabolism等通路發(fā)揮作用，從而改善腦缺血再灌注后損傷情況。

表1 紅花、乙酰谷酰胺、谷紅注射液共同通路Tab.1 The common pathways of safflower, acetylglutamine and Guhong injection

注：#表示為某一大類通路概念，故無相應的編號。

4.4 主要活性成分預測

基于BATMAN-TCM平臺得到化學成分對應靶點，與共有靶點對比篩選得潛在作用成分131個，其中部分作用成分見下表2，主要有L-Lysin、L-glutamic acid、4-aminobutyric acid、Dotriacontanol、hydroxysafflor-yellow-A、safflomin-A等。

表2 部分主要活性成分Tab.2 Some of the main active ingredients

4.5 成分-靶點-通路網(wǎng)絡構建

用Cytoscape 3.5.1軟件構建谷紅注射液抗腦缺血“成分-靶標-通路”網(wǎng)絡作用圖，得到圖3，由網(wǎng)絡圖可知，谷紅注射液有131個化學成分共同直接或間接作用于748個靶點，分別富集到氨基酸代謝、鈣信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、氨酰-tRNA的生物合成、脂質(zhì)代謝和其他氨基酸的代謝等通路，發(fā)揮相應的協(xié)同作用以改善腦缺血再灌注損傷。

圖3 谷紅注射液抗腦缺血成分-靶標-通路網(wǎng)絡圖Fig.3 The compound-target-pathway network diagram of Guhong injection against cerebral ischemia-reperfusion injury

4.6 核心靶標篩選及網(wǎng)絡構建

基于STING數(shù)據(jù)庫，將748個靶標導入數(shù)據(jù)庫平臺，靶點間連接置信度設置為0.9，建立靶點間的相互作用關系。根據(jù)Cytoscape中apps項下Centiscape 2.2和MCODE板塊進行核心網(wǎng)絡分析，根據(jù)其Degree、Betweeness、Closeness值綜合評分(Score：35.302)，從大網(wǎng)絡中提取獲得的核心作用靶標64個，其網(wǎng)絡見圖4。根據(jù)節(jié)點Degree值大小可表明該節(jié)點在核心網(wǎng)絡中的重要程度，可見網(wǎng)絡中主要核心靶點有AGT、BDKRB2、NMUR2、IL8、AVP、CXCR4、AGTR1、CHRM2、EDN1、PF4和AGTR2等。其中最為核心的靶標是AGT(血管緊張素原)、BDKRB2(緩激肽B2受體抗體)、NMUR2(神經(jīng)調(diào)節(jié)肽U受體2)、IL8(白介素-8)、AVP(血管加壓素)和CXCR4(趨化因子受體)等。

圖4 核心作用靶標圖Fig.4 The key target network

5 討論

谷紅注射液為中西藥聯(lián)合用藥，主要由乙酰谷酰胺和紅花提取液組成，常用于治療急性腦梗死、腦供血不足、腦血栓、腦出血和血管性認知障礙等腦血管疾病，具有較高的臨床應用價值[11,19]。乙酰谷酰胺是谷氨酰胺乙?；难苌?，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮藥，可透過血腦屏障后分解為γ-氨基丁酸和谷氨酸，繼而發(fā)揮治療腦功能、腦神經(jīng)功能損傷作用。目前臨床單用或是聯(lián)合其他藥物用于治療腦缺血、腦功能衰退和腦血管后記憶力衰退和改善神經(jīng)細胞代謝等腦部疾病[20]。紅花提取液主要活性成分有紅花黃色素、羥基紅花黃色素、紅花苷、黃酮類和酚酸類等，具有良好的活血化瘀功效，可減輕缺血性心腦血管損傷、抗氧化應激等作用[21-22]。二者聯(lián)合使用，加強了其在治療心腦血管疾病方面的共同作用，得到較好臨床應用效果。本研究主要考察了谷紅注射液干預腦缺血再灌注后大鼠腦梗死面積以及神經(jīng)功能評分情況，結果發(fā)現(xiàn)，谷紅注射液干預后可顯著降低神經(jīng)行為學評分，減輕大鼠腦梗死面積。進而采用網(wǎng)絡藥理學方法，構建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡圖，篩選出與腦缺血再灌注損傷相關化合物131個，相關作用靶標748個，共涉及12條作用通路。

其中，分析發(fā)現(xiàn)與腦缺血再灌注損傷相關化合物131個，主要包括L-賴氨酸，L-谷氨酸，γ-氨基丁酸，三十二烷醇，羥基紅花黃色-A和紅花素-A等活性成分。其中L-賴氨酸為人體必需氨基酸，其臨床常用制劑鹽酸賴氨酸注射液為腦病患者輔助藥品，可治療腦組織出血和缺氧性疾病[23]；紅花黃色素A與羥基紅花黃色素A可改善腦血流量，減輕腦梗死面積，并通過抑制興奮性氨基酸產(chǎn)生的神經(jīng)毒性、抗氧化應激、抗神經(jīng)細胞凋亡和抑制炎癥反應等作用達到抗腦缺血或缺血再灌注后大腦損傷[21-22]。

進一步對谷紅注射液748個作用靶標網(wǎng)絡特征分析，得到谷紅注射液治療腦缺血再灌注損傷核心網(wǎng)絡靶標64個，核心節(jié)點主要有AGT、BDKRB2、NMUR2、IL-8、AVP、CXCR4、AGTR1、CHRM2、EDN1、PF4和AGTR2等。其中AGT(血管緊張素原)是腦內(nèi)經(jīng)典腎素-血管緊張素(RAS)通路的關鍵作用環(huán)節(jié)，能夠生成一系列血管緊張素，如：血管緊張素-I (Ang I)、血管緊張素- II(Ang II)、血管緊張素-(1-7)[Ang-(1-7)]等，進而發(fā)揮血壓調(diào)節(jié)、水電解質(zhì)的平衡、保護腦缺血再灌注損傷等重要作用[24]；有研究報道，缺血性腦卒中患者相比正常人IL-8(白介素-8)mRNA表達增加，血漿中IL-8水平升高，表明其與腦缺血損傷有關，且隨著病程的延長，IL-8水平升高加重腦損傷的程度[25-26]；EDN1(內(nèi)皮素1)是具有血管收縮活性的一種活性多肽，對腦缺血過程中產(chǎn)生的氧化應激反應具有很好的調(diào)節(jié)作用[27]。

通過對作用靶標的功能富集分析發(fā)現(xiàn)，谷紅注射液與紅花、乙酰谷酰胺共同涉及12條作用通路，主要包括氨基酸代謝、鈣信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、氨酰-tRNA的生物合成、脂質(zhì)代謝和其他氨基酸的代謝等。其中氨基酸代謝、鈣信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等為腦缺血再灌注損傷過程中主要涉及作用通路，且各通路與通路之間相互關聯(lián)、相互作用，如腦缺血后，細胞突觸間隙堆積大量興奮性氨基酸，包括氨基酸、天冬氨酸等，它們可激活谷氨酸AMPA和NMDA受體，進而引起Ca2+的大量內(nèi)流，激活下游鈣離子依賴性的死亡通路，引起神經(jīng)細胞及膠質(zhì)細胞發(fā)生壞死或者凋亡[28]，進一步加重腦缺血損傷。

綜上所述，我們通過實驗證明谷紅注射液具有良好的腦缺血再灌注保護作用。進一步通過網(wǎng)絡藥理學分析表明，谷紅注射液主要通過紅花提取液中的羥基紅花黃色素-A、紅花素-A、L-賴氨酸和乙酰谷酰胺代謝產(chǎn)生的γ-氨基丁酸和L-谷氨酸等活性成分，調(diào)節(jié)BDKRB2、AGT、IL-8、EDN1、AVP等核心靶標，共同干預氨基酸代謝、鈣信號通路和神經(jīng)活性配體-受體相互作用等通路，以達到抗腦缺血再灌注損傷協(xié)同保護作用。但對于谷紅注射液的主要活性成分及其作用機制還有待進一步的實驗驗證，以闡述其確切藥效物質(zhì)基礎及作用機制。同時，本次研究為中西藥聯(lián)合使用類型制劑的合理性、實用性以及有效性提供了一定的科學研究思路與方法。