高嘉駿，陳志耿，林震溪

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122）

草果知母湯為《溫病條辨》所首載，著名內(nèi)經(jīng)學(xué)家王洪圖根據(jù)《內(nèi)經(jīng)》脾胃的氣機(jī)轉(zhuǎn)樞理論，從調(diào)節(jié)脾胃入手，應(yīng)用加減草果知母湯治療癲癇，經(jīng)過多年的臨床觀察和動物實(shí)驗(yàn)均表明草果知母湯對癲癇治療效果明確［1-5］。為進(jìn)一步探討草果知母湯抗癇的可能作用機(jī)制，本課題復(fù)制戊四唑（PTZ）慢性誘導(dǎo)致癇的動物模型，觀察草果知母湯對癲癇大鼠行為學(xué)、腦海馬組織病理學(xué)、神經(jīng)元凋亡變化、miRNA和凋亡相關(guān)基因表達(dá)等指標(biāo)的影響，為草果知母湯的臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性SD大鼠60只，體重180～220 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，合格證號：SCXK（滬）2012-0002，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級動物房，濕度（55±5）%，室溫（22±2）℃，12∶12 h 光暗循環(huán)。

1.2 藥物及制備 草果、知母、厚樸、半夏、黃芩、甘草等中藥均購自福建省藥材公司，由福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊成梓教授鑒定。按照原處方，在蒸餾水中煮沸兩次，每次煎煮1 h；然后將溶液在真空下干燥濃縮成 0.375、0.75、1.5 g／mL 生藥 3 種濃度提取液，冷藏備用。

1.3 主要試劑與儀器 Bax、Bcl-2、P53抗體（英國abcam 公司）；PTZ（美國 Sigma公司）；超純 RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real－time PCR試劑盒、SYBR Premix Ex Taq寶生物染料法熒光定量試劑盒（日本TaKaRa公司）；Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；QL-902渦旋振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Centrifuge 5415D離心機(jī)（德國 Eppendorf公司）；NANODROP 2000分光光度計(jì)（美國 Therno scientific公司）；ABI 7500熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.4 模型制備及給藥 60只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成5組：正常組，模型組，草果知母湯低、中、高劑量組。除正常組外，其余4組均參考張麗萍等癲癇模型的制備方法造模［1-5］。模型組，草果知母湯低、中、高劑量組均以PTZ亞驚厥劑量35 mg／kg腹腔注射，1次／d，持續(xù)4周。停藥1周后于第5周末，再次用相同劑量PTZ進(jìn)行末次點(diǎn)燃測試。大鼠驚厥發(fā)作依據(jù)七點(diǎn)評分法［6］為評判標(biāo)準(zhǔn)，凡顯示連續(xù)5次以上Ⅱ級或Ⅱ級以上驚厥為達(dá)到點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)，Ⅳ～Ⅵ級的癇性行為被視為充分點(diǎn)燃。各組在造模1 h后即開始給藥：正常組、模型組以雙蒸水2 mL／kg灌胃，草果知母湯低、中、高劑量組分別以0.375、0.75、1.5 g／mL生藥提取液 2 mL／kg灌胃， 每日 1次，持續(xù) 28 d。

1.5 取材 第5周末待所有大鼠行為學(xué)觀察完成后，將各組大鼠以10%水合氯醛3 mL／kg腹腔注射麻醉，斷頭取腦，迅速在含有生理鹽水的冰面上鈍性分離出雙側(cè)海馬組織。左腦海馬立即進(jìn)行4%多聚甲醛固定，制備海馬組織石蠟標(biāo)本，以5 μm厚連續(xù)切片，備HE染色及TUNEL法檢測使用；右腦海馬組織凍存于－80℃液氮中備PT-PCR檢測及Western Blot印跡分析使用。

2 指標(biāo)檢測

2.1 觀察草果知母湯對癲癇大鼠行為學(xué)的影響每天給藥后觀察各組大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)2 h，癲癇發(fā)作時(shí)使用 Sanya EO等人的方法［7］進(jìn)行評分，分級包括：0級，活動無變化，無響應(yīng)，計(jì)0分；I級，前肢或后肢抓扒或凝視＞5 s，計(jì)1分；Ⅱ級，I級加上抬身、點(diǎn)頭或雙側(cè)肢體抓扒，計(jì)2分；III級，跳躍、擺動或跌倒，計(jì)3分；IV級，癲癇持續(xù)狀態(tài)或死亡，計(jì)4分。

2.2 HE染色后行組織病理學(xué)觀察 取腦海馬組織切片（5 μm）置于載玻片上，65℃ 烘烤 3～5 h，脫蠟，經(jīng)蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后，在光學(xué)顯微鏡（400倍）下觀察組織病理學(xué)變化。

2.3 TUNEL法檢測各組癲癇大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 海馬組織的脫蠟同2.2述操作。① 滴加 20 μg／mL 不含 DNase的蛋白酶 K（室溫，30 min），PBS洗3次；② 3%過氧化氫溶液中室溫孵育10 min，PBS洗3次；③ 加50 μL生物素標(biāo)記液于切片上，37℃孵育 60 min，PBS洗 1次；④ 加 0.2 mL反應(yīng)終止液，室溫孵育10 min，PBS洗3次；⑤ 按說明書配Streptavidin-HRP工作液和DAB顯色液；⑥蘇木素復(fù)染，封片；⑦ 光學(xué)顯微鏡（400倍）下觀察，每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)視野，獲取圖像。TUNEL法表現(xiàn)為棕色或深棕色細(xì)胞核染色，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，其表達(dá)增加。結(jié)果用多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)分析，用平均灰度值進(jìn)行半定量分析。以陽性細(xì)胞的百分率作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 RT-PCR檢測大鼠海馬組織miR-21、miR-29和凋亡相關(guān)基因 Bax、Bcl-2、P53 mRNA表達(dá) 用超純RNA提取試劑提取海馬組織樣本中 RNA，取5 μL總RNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳；接著，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的gDNA Eraser對RNA中殘留的基因組DNA進(jìn)行消化處理，繼而用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；最后，使用ABI 7500型熒光定量PCR儀及SYBR Premix Ex Taq進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋孩?預(yù)變性，95℃ 30 s；② PCR反應(yīng) 40個(gè)循環(huán)，95℃5 s，60℃ 34 s；③ 解離。根據(jù)反應(yīng)結(jié)果讀取數(shù)值，采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。引物由上海introvigen公司合成，引物序列見表1：

表1 引物序列

2.5 Western Blot法分析凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2、P53蛋白表達(dá) 將分離的海馬組織用含有蛋白酶抑制劑混合物（PMSF）的RIPA裂解緩沖液在冰上裂解，然后將它們置高速離心機(jī)中，4℃，12 000 rmp離心15 min；收集裂解物，并通過BCA法測定蛋白質(zhì)濃度；蛋白質(zhì)在12%密度SDS丙烯酰胺凝膠上電泳，使用電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，采用 P53 抗體（1∶1 000）、P-BAD（1∶500）、Bax（1∶1 000）、裂解 PARP（1∶1 000）、Bcl xL（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）和 β-肌動蛋白（1∶10）于 4℃中孵育過夜，用第二抗體（1∶7 000）在室溫下孵育 2 h；最后，使用Image Lab分析軟件上的ECL Western檢測試劑對它們進(jìn)行評估，使用β-肌動蛋白作為內(nèi)參。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理分析。計(jì)量資料屬正態(tài)分布以（x±s）表示，多組數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 草果知母湯對癲癇大鼠行為學(xué)的影響 如表2所示，正常組大鼠未觀察到驚厥，但模型組大鼠與正常組相比表現(xiàn)出嚴(yán)重的驚厥。草果知母湯中、高劑量組顯示出明顯的抗驚厥作用（p＜0.05或0.01）。

表2 各組大鼠不同時(shí)相驚厥等級評分比較分

表2 各組大鼠不同時(shí)相驚厥等級評分比較分

注：與模型組比較，1） p＜0.05，2） p＜0.01。

組別正常組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n88888第1周00000第2周0 1.91±0.65 1.86±0.61 1.32±0.241）1.28±0.351）第3周0 2.96±0.58 2.22±0.51 1.96±0.421）1.82±0.532）第4周0 4.11±0.63 3.98±0.59 2.24±0.561）2.01±0.562）第5周0 5.34±0.76 5.10±0.62 2.45±0.532）2.11±0.612）

3.2 草果知母湯對癲癇大鼠海馬區(qū)組織病理學(xué)的影響 正常組海馬細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰可見，細(xì)胞膜、細(xì)胞核和組織間隙均正常（見圖1）；模型組海馬細(xì)胞排列紊亂，核仁皺縮，核仁斷裂，胞漿離散，空泡樣變性；草果知母湯中、高劑量組神經(jīng)元形態(tài)未見明顯異常。

圖1 草果知母湯對癲癇大鼠海馬區(qū)組織病理學(xué)的影響（×400）

3.3 草果知母湯對癲癇大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL染色法結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加，具有非常顯著差異（p＜0.01）；與模型組比較，草果知母湯中、高劑量組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少，具有非常顯著性差異（p＜0.01）。 見圖 2。

圖2 TUNEL染色法結(jié)果（×400）

3.4 草果知母湯對癲癇大鼠海馬組織miR-21、miR-29和 Bax、Bcl-2、P53 mRNA表達(dá)的影響 見表3。

表3 草果知母湯對癲癇大鼠海馬組織miR-21、miR-29和Bax、Bcl-2、P53 mRNA表達(dá)的影響

表3 草果知母湯對癲癇大鼠海馬組織miR-21、miR-29和Bax、Bcl-2、P53 mRNA表達(dá)的影響

注：與正常組比較，1） p＜0.05，2） p＜0.01；與模型組比較，3） p＜0.05，4） p＜0.01。

組別正常組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n88888 miR-21 2.103±0.35 0.851±0.05 0.902±0.552）1.364±0.631）3）1.989±0.864）miR-29 1.23±0.24 2.03±0.162）1.90±0.362）1.56±0.161）3）1.485±0.914）Bax 1.18±0.02 1.88±0.022）1.72±0.042）1.51±0.011）3）1.46±0.364）Bcl-2 1.15±0.02 0.53±0.0122）0.65±0.0332）0.96±0.0561）3）1.11±0.0714）P53 1.27±0.26 3.14±0.872）2.53±0.122）2.10±0.481）3）1.95±0.774）

3.5 草果知母湯對癲癇大鼠海馬組織 Bax、Bcl-2、P53蛋白表達(dá)的影響 草果知母湯對癲癇大鼠海馬組織 Bax、Bcl-2、P53蛋白表達(dá)的影響見圖3。結(jié)果表明：與正常組比較，模型組的 Bax、P53蛋白表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)減少，差異具有非常顯著性（p＜0.01）。與模型組比較，草果知母湯低、中、高劑量 Bax、P53蛋白表達(dá)有不同程度降低（p＜0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)增加（p＜0.01）。

4 討 論

已有藥理研究表明：草果知母湯具有良好的抗癲癇作用，可顯著改善癲癇行為，改善腦組織學(xué)變化，減少 GABA和 GABAAR mRNA的表達(dá)［2-5］。本課題重復(fù)使用亞驚厥劑量的PTZ，成功復(fù)制目前公認(rèn)的大鼠癲癇實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?2-13］。草果知母湯的給藥可明顯減輕PTZ點(diǎn)燃大鼠癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度，再次驗(yàn)證了其對癲癇的治療作用。

圖3 草果知母湯對癲癇大鼠Bax、Bcl-2、P53蛋白表達(dá)的影響

癲癇伴隨著多種病理生理過程，其中，細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是主要機(jī)制之一。研究證明嚴(yán)重的神經(jīng)元細(xì)胞死亡，主要發(fā)生在海馬區(qū)域［14-15］。通過觀察，PTZ誘導(dǎo)癲癇大鼠海馬細(xì)胞的凋亡，與癲癇發(fā)作的強(qiáng)度是一致的。通過HE染色和TUNEL法染色結(jié)果，草果知母湯對此具有一定的改善作用。而其抗驚厥作用，與之前研究一致［2-4］。

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類長度約22個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA，miRNA通過與靶基因的特定序列相互作用，在轉(zhuǎn)錄后抑制活性或者使其降解，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。近年來，越來越多的miRNAs被發(fā)現(xiàn)，并被認(rèn)為參與調(diào)控神經(jīng)分化、生物發(fā)育、細(xì)胞增殖和凋亡等過程，是細(xì)胞增殖分化過程中重要的調(diào)控因子。有研究表明miR-21、miR-29通過調(diào)控線粒體凋亡途徑中的多種蛋白來參與調(diào)控細(xì)胞凋亡［16-18］。因此為了進(jìn)一步探索草果知母湯保護(hù)作用的可能機(jī)制，我們研究了草果知母湯對miR-21、miR-29和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，結(jié)果表明草果知母湯可通過下調(diào)miR-29、上調(diào)miR-21的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑中相關(guān)基因的表達(dá)而發(fā)揮抗癲癇作用，同時(shí)，Bax、P53 mRNA表達(dá)有不同程度降低，Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)有不同程度增加。

總之，草果知母湯可顯著降低PTZ誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作，通過下調(diào)miR-29、上調(diào)miR-21的表達(dá)靶向調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bax、P53和Bcl-2表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗癲癇作用。草果知母湯是治療癲癇的潛在候選藥物，由于其成分復(fù)雜，其抗癲癇作用是多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的，相關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。