王會敏，何柯新，尚陳宇，劉冬冬，徐建華

1.廣東省中醫(yī)院二沙島分院，廣東 廣州 510130；2.廣州市惠愛醫(yī)院，廣東 廣州 510370

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種與年齡密切相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為慢性、進行性的認(rèn)知障礙，主要病理特征之一的淀粉樣斑是由β 淀粉樣肽(Amyloid-β peptide，Aβ)異常沉積形成的[1～2]。表沒食子兒茶素表沒食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是綠茶多酚的主要有效成分，EGCG具有抗氧化、抗炎、抗癌、保護心腦血管及延緩衰老等作用，能夠穿透血腦屏障進入中樞，保護神經(jīng)，有效改善AD患者的學(xué)習(xí)認(rèn)知障礙[3～4]，但機制并未闡明。本研究從動物實驗的角度研究綠茶提取物EGCG對D-半乳糖誘導(dǎo)的AD模型小鼠Aβ生成效果的影響，為深入研究抗AD新藥的機制提供客觀依據(jù)和理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康8周齡清潔級昆明小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供(合格證號：00178105)。實驗過程中的動物飼養(yǎng)及取材均遵守實驗動物管理和保護的有關(guān)規(guī)定。

1.2 儀器與試劑 LW-Ⅱ型水迷宮和WX-2型小鼠電光刺激條件反射跳臺、Epics-XL型流式細(xì)胞儀、TC 2323型CO2孵箱、752型紫外光柵分光光度計、EGCG(Sigma公司)、D-半乳糖、維生素E、人源Aβ40和Aβ42、ELISA試劑盒(Covance公司)。

1.3 藥物處理與分組 取昆明小鼠60只，隨機分為6組，每組10只，分別為對照組、模型組、VE陽性組、EGCG低劑量組、EGCG中劑量組、EGCG高劑量組。實驗室常規(guī)飼養(yǎng)3天后，對照組每天頸背部皮下注射生理鹽水，其余各組每天按150mg/kg體質(zhì)量頸背部皮下注射3%的D-半乳糖，持續(xù)21天。造模7天后，對照組和模型組灌胃等量雙蒸水；VE陽性組每天按280 IUmg/kg灌胃5.6%VE 1次；EGCG低、中、高劑量組分別按每天2 mg/kg灌胃0.04%EGCG、4 mg/kg灌胃0.08%EGCG、6mg/kg灌胃0.12%EGCG 1次；持續(xù)給藥28天。

1.4 避暗試驗 實驗裝置為四周是黑色塑料板，箱底鋪銅柵的箱，箱內(nèi)右后方放1個橡皮墊作為小鼠逃避電擊的安全區(qū)，可調(diào)變壓器控制電流強度。將小鼠放入箱中自由活動3min，熟悉環(huán)境，然后箱底通以電流，其正常反應(yīng)是跳上平臺以躲避傷害性刺激。從放入小鼠到第1次跳下平臺受電擊的時間作為潛伏期，以5min內(nèi)跳下平臺受電擊的次數(shù)為錯誤數(shù)，作為小鼠學(xué)習(xí)成績。24h后，再將鼠置于平臺上，重復(fù)上述操作并記錄。

1.5 Morris水迷宮試驗 迷宮有4個盲端，終點是1個略高出水平面的安全臺。實驗步驟：第1天包括2個盲端，第2天包括3個盲端，第3、4、5天均包括4個盲端。每天訓(xùn)練2次，記錄5天每只小鼠進入盲端的次數(shù)和游出時間。

1.6 病理形態(tài)學(xué)觀察 末次給藥后24 h，稱重，將各組小鼠按40mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，無菌條件下取腦組織，10%甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片，進行HE染色，每只小鼠腦組織制作2張切片，隨機抽取1張在高倍顯微鏡下隨機選取5個視野觀察，倒置顯微鏡分析圖像。

1.7 檢測腦組織勻漿中IL-2、IL-6、TNF-α和Aβ水平 取小鼠腦組織置冰生理鹽水中洗凈血液，用濾紙吸去水分稱重，用pH 7.4的PBS按1∶10稀釋冰浴下勻漿，轉(zhuǎn)速3 000 g離心5min，按試劑盒操作測定腦組織中IL-2、IL-6、TNF-α 含量和Aβ 水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以(±s)表示，進行單因素方差分析和顯著性檢驗。預(yù)先用HomogeneityofVariances進行方差齊性檢驗，如方差不齊采用Tamhane's T2檢驗，方差齊采用LSD檢驗和S-N-K檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠跳臺活動檢測結(jié)果比較 見表1。與對照組比較，模型組小鼠跳臺錯誤次數(shù)明顯增加(P＜0.01)，跳臺潛伏期明顯縮短(P＜0.01)；與模型組比較，EGCG中、高劑量和VE陽性組的小鼠跳臺錯誤次數(shù)均明顯降低(P＜0.01)，跳臺潛伏期明顯延長(P＜0.05，P＜0.01)；EGCG低劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組小鼠跳臺活動檢測結(jié)果比較(±s)

表1 各組小鼠跳臺活動檢測結(jié)果比較(±s)

與對照組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05，③P＜0.01

組 別對照組模型組VE陽性組EGCG低劑量組EGCG中劑量組EGCG高劑量組n 學(xué)習(xí) 記憶10 10 10 10 10 10潛伏期(s)53±37 35±29①58±51②44±37 56±49③61±45③錯誤次數(shù)(次)1.56±0.68 4.60±2.13①3.81±1.52②4.32±2.88 3.71±2.75②3.29±1.99②潛伏期(s)295±61 144±44①192±50②176±57 198±61②234±70③錯誤次數(shù)(次)0.99±0.29 3.92±1.33①3.08±1.27③3.62±2.25 2.98±0.99②2.62±0.85③

2.2 各組小鼠水迷宮實驗檢測結(jié)果比較 見表2、表3。在水迷宮試驗中，訓(xùn)練的第1天和第2天，與對照組比較，模型組小鼠通過水迷宮的時間顯著延長，進入盲端的次數(shù)顯著增加(P＜0.01)。與模型組比較，第1天和第2天，EGCG低、中、高劑量組小鼠通過水迷宮時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；而在訓(xùn)練的第3、4、5天，EGCG中、高劑量組和VE陽性組小鼠通過迷宮時間顯著縮短(P＜0.05)，進入盲端的次數(shù)也顯著減少(P＜ 0.05，P＜ 0.01)。

2.3 各組小鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)結(jié)果比較 見圖1。HE染色結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組小鼠海馬C2區(qū)顆粒層神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量明顯減少，排列紊亂，部分神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生核固縮，細(xì)胞膜核膜界限模糊、胞漿深染，部分可見壞死的神經(jīng)元細(xì)胞，大腦皮層可見明顯的神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生核固縮，核周空染，周圍間質(zhì)神經(jīng)纖維明顯變疏松。EGCG低劑量組小鼠海馬齒狀回顆粒層神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生明顯的固縮，細(xì)胞核周圍可見明顯的空染區(qū)域，神經(jīng)纖維變得明顯疏松，顆粒層變薄，大腦皮層中神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生明顯的核固縮，周圍可見空染區(qū)域，神經(jīng)纖維變得疏松。EGCG中劑量組小鼠海馬C2區(qū)，顆粒層神經(jīng)元細(xì)胞可見有少量發(fā)生核固縮，顆粒層變薄，周圍神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)有些疏松，大腦皮層中可見少量神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生核固縮，周圍結(jié)構(gòu)空染，神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)變得疏松。EGCG高劑量組和VE陽性組小鼠海馬各區(qū)未見明顯的病理改變，顆粒層細(xì)胞排列規(guī)則，未見變少，也未見明顯的固縮，大腦皮層未發(fā)現(xiàn)明顯病理改變，神經(jīng)元細(xì)胞未見發(fā)生核固縮。

2.4 各組小鼠腦組織勻漿中IL-2、IL-6、TNF-α含量比較見表4。與對照組比較，模型組小鼠腦組織IL-2水平降低(P＜0.01)，IL-6和TNF-α 水平升高(P＜0.01)。與模型組比較，EGCG中、高劑量組和VE陽性組小鼠腦組織IL-2水平顯著升高，IL-6和TNF-α 水平顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)。

2.5 各組小鼠腦內(nèi)Aβ水平檢測結(jié)果比較 見圖2。與對照組比較，模型組小鼠腦內(nèi)Aβ40水平升高，差異有統(tǒng)計性意義(P＜0.01)。與模型組比較，EGCG低劑量組小鼠腦內(nèi)Aβ40水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組比較，EGCG中、高劑量組和VE陽性組小鼠腦內(nèi)Aβ40水平逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，且Aβ40水平的下降呈劑量依賴性(圖2A)。Aβ42水平的下降呈現(xiàn)相同的趨勢(圖2B)，說明EGCG抑制Aβ 的分泌水平呈劑量依賴性。

表2 各組小鼠通過水迷宮時間比較(±s) s

表2 各組小鼠通過水迷宮時間比較(±s) s

與對照組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05

組 別對照組模型組VE陽性組EGCG低劑量組EGCG中劑量組EGCG高劑量組n 10 10 10 10 10 10第1天92.1±26.5 164.9± 80.1①128.5±47.9 159.6±43.6 154.0±26.6 145.9±40.1第2天72.1±23.7 132.0± 65.5①108.6±44.8 138.1±40.2 122.2±27.9 115.4±38.1第3天50.2±23.4 118.4± 47.7①89.7± 39.9②104.8±38.1 94.9± 28.4②90.0± 34.4②第4天33.9±21.1 98.3±29.7①76.1± 30.2②90.2±33.3 83.2± 22.9②77.4± 26.1②第5天26.4±17.2 81.9±23.8①65.0±30.1②76.5±23.4 70.2± 19.7②63.9± 25.2②

表3 各組小鼠進入水迷宮盲端錯誤次數(shù)比較(±s)次

表3 各組小鼠進入水迷宮盲端錯誤次數(shù)比較(±s)次

與對照組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05，③P＜0.01

組 別對照組模型組VE陽性組EGCG低劑量組EGCG中劑量組EGCG高劑量組n 10 10 10 10 10 10第1天6.5±3.1 9.4± 4.6①8.6±4.5 9.1±3.8 8.8±4.0 8.6±4.2第2天4.9±2.2 8.9± 4.2①8.1±2.3 8.6±4.1 8.2±3.5 7.9±2.3第3天4.0±2.1 7.9± 4.0①6.9± 1.2②7.3±3.5 6.1± 1.8②5.4± 2.3②第4天2.2±1.0 7.1± 2.7①4.9± 1.8②6.4±2.8 5.2±1.6②4.6± 2.5③第5天1.2±1.1 6.3± 2.9①4.3± 1.5②5.2± 3.1②4.7± 1.5②4.0± 1.2③

圖1 各組小鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)比較 (×200)

表4 各組小鼠腦組織勻漿中IL-2、IL-6、TNF-α含量比較(±s) pg/g

表4 各組小鼠腦組織勻漿中IL-2、IL-6、TNF-α含量比較(±s) pg/g

與對照組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05，③P＜0.01

組 別對照組模型組VE陽性組EGCG低劑量組EGCG中劑量組EGCG高劑量組n 10 10 10 10 10 10 IL-2 995.26±30.21 551.88±20.12①850.35±18.90③649.76±10.21 782.65±25.38②959.84±51.21③TNF-α 702.44±35.13 1 386.10±96.22①713.19±49.37③1 199.45±33.89 907.44±42.90②709.11±39.88③IL-6 1 134.12±33.89 1 936.54±50.29①1 310.25±45.65③1 788.45±36.31 1 459.39±39.26②1 290.85±44.12③

圖2 各組小鼠腦內(nèi)Aβ水平檢測結(jié)果

3 討論

AD伴有記憶減退和認(rèn)知障礙[5～6]，本研究通過避暗試驗和水迷宮試驗發(fā)現(xiàn)，EGCG處理后的AD小鼠認(rèn)知和記憶行為得到明顯的改善，尤其是中劑量和高劑量EGCG處理后，可以明顯減少小鼠跳臺發(fā)生的錯誤次數(shù)，延長跳臺潛伏期；縮短游出迷宮時間和減少進入盲端的錯誤次數(shù)。提示長期應(yīng)用EGCG有利于改善AD病人的認(rèn)知和記憶障礙，EGCG保護腦神經(jīng)作用可能是通過提高機體抗氧化能力，減少氧自由基和過氧化物質(zhì)的生成實現(xiàn)的。

β-淀粉樣前體蛋白在β-分泌酶和γ-分泌酶的剪接作用下，發(fā)生錯誤折疊，造成纖維狀A(yù)β在腦內(nèi)的異常堆積，由于Aβ可增強興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的毒性、致使細(xì)胞內(nèi)鈣失衡，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。本研究通過檢測EGCG對D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型小鼠腦內(nèi)IL-6、TNF-α、IL-2和Aβ 表達(dá)的影響來探討EGCG的神經(jīng)保護作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組小鼠經(jīng)D-半乳糖處理后腦內(nèi)的IL-6、TNF-α 和Aβ表達(dá)水平明顯增加，IL-2水平明顯降低，同時發(fā)現(xiàn)應(yīng)用EGCG低、中、高劑量處理后可明顯減少D-半乳糖誘導(dǎo)AD小鼠腦內(nèi)IL-6、TNF-α 和Aβ 表達(dá)水平，升高IL-2水平，并呈劑量依賴性。提示EGCG可能通過降低IL-6、TNF-α 和Aβ 對神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用，發(fā)揮對D-半乳糖誘導(dǎo)的AD模型鼠的腦部病理改變的保護作用。至于EGCG的進一步神經(jīng)保護作用有待進一步研究。

D-半乳糖在半乳糖氧化酶的作用下氧化成醛和H2O2，產(chǎn)生大量氧自由基，降低抗氧化酶的活性，影響滲透壓，使細(xì)胞腫脹，細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、脂褐素沉積[7]，細(xì)胞代謝紊亂，加速衰老和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生，包括神經(jīng)元數(shù)目減少，腦組織中SOD活性下降，從而產(chǎn)生一系列與AD相似的行為和病理改變[8～10]。本實驗已證實D-半乳糖可誘導(dǎo)小鼠認(rèn)知和記憶能力減退等行為改變，可模擬AD的部分病變，經(jīng)HE染色顯示，D-半乳糖長期作用的小鼠大腦皮層及海馬區(qū)神經(jīng)元脫失，數(shù)量明顯減少，細(xì)胞排列稀疏、紊亂，局部神經(jīng)元之間間隙增大，出現(xiàn)較多呈固縮狀的壞死神經(jīng)元。經(jīng)EGCG治療的模型小鼠大腦皮層和海馬中可見神經(jīng)元數(shù)量增多，體積增大，排列整齊，核圓，核仁明顯，少有神經(jīng)元壞死現(xiàn)象。提示EGCG能夠減輕D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠海馬神經(jīng)元的損傷，對AD模型小鼠有一定的保護作用。

EGCG具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤及降低血脂和清除膽固醇等生物學(xué)活性，尤其是神經(jīng)保護作用也越來越受到重視。研究顯示，EGCG能夠延長桿狀線蟲的生命周期，并改善其年齡相關(guān)的一些行為改變[11～12]，EGCG能夠激活細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)，減少外加Aβ 引起的細(xì)胞氧化損傷和細(xì)胞凋亡[13]，Dragicevic N等[14]研究發(fā)現(xiàn)，EGCG能顯著改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中由于Aβ過量產(chǎn)生導(dǎo)致的氧化損傷和線粒體功能障礙。此外，EGCG能夠明顯改善Tg2576小鼠的認(rèn)知功能障礙，并抑制Tau蛋白的過度磷酸化[15]。

綜上，EGCG可以降低D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型小鼠腦內(nèi)IL-6、TNF-α 和Aβ 的生成，并呈劑量依賴性，來發(fā)揮其神經(jīng)保護作用，但其中的機制有待進一步研究。