吳潔婷，楊東廣，王 立，包紅旭，趙 磊，馬 放

1.遼寧大學環(huán)境學院，遼寧 沈陽 110036 2.哈爾濱工業(yè)大學城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150090

近年來，經(jīng)濟的高速發(fā)展促使化石燃料大量使用，隨著污水、污泥用于農(nóng)用灌溉及汽車尾氣排放污染加劇等現(xiàn)象的增多，環(huán)境中重金屬含量逐年增高，生態(tài)環(huán)境(土壤、大氣、水體等)的污染程度也日趨嚴重。重金屬因其具有易于生物積累并可生物放大等特點，已成為環(huán)境污染修復一大難題[1]，因此“十三五”以來，對環(huán)境中重金屬污染進行分析監(jiān)測，進而從源頭預防污染發(fā)生并進行末端污染治理等研究工作均受到學者的廣泛關注[2-3]。通過對植物中重金屬的賦存形態(tài)及分布特征進行分析，進而對環(huán)境中大氣、土壤的重金屬污染來源、污染程度進行監(jiān)測及解析，有助于對重金屬污染起到生態(tài)預警的作用，同時也為構建合理的植物修復方案提供理論依據(jù)[4]。

目前通過指示植物(如苔蘚、地衣)或者部分植物組織(如樹葉、樹皮等)監(jiān)測環(huán)境的重金屬污染狀況，或?qū)χ参镄迯托ЧM行評價的研究較多[5-6]。選擇合適的方法對植物體內(nèi)金屬的賦存形態(tài)、分布特征2方面進行解析，對于研究重金屬的生物有效性及毒性作用、篩選出具有優(yōu)良性狀的植物品系、監(jiān)測部分地區(qū)重金屬污染狀況、評價污染場地植物修復效果等具有重要意義。筆者對國內(nèi)外有關植物中重金屬賦存形態(tài)、分布特征的分析方法研究進展進行了概述，并比較了不同分析方法的優(yōu)缺點，展望其未來發(fā)展趨勢，以期為新分析方法的研究提供參考。

1 植物內(nèi)重金屬賦存形態(tài)分析方法

目前重金屬的賦存形態(tài)分類較多，其中湯鴻霄[7]提出的“價態(tài)、化合態(tài)、結合態(tài)和結構態(tài)”理論認可度最高。根據(jù)不同的分類方法，其測定方法的選擇也不盡相同，所以迄今為止并未有統(tǒng)一的標準，可根據(jù)實驗條件、實驗要求、重金屬含量與形態(tài)、植物種類等因素進行選擇。按照分析步驟可分為間接分析法和直接分析法：間接分析法是利用化學提取劑或者色譜儀等分離儀器基于不同重金屬形態(tài)的物理化學性質(zhì)的差異，將其進行提取或分離，再進行總量測定，從而得到各種形態(tài)的重金屬含量；直接分析法是指利用光譜等技術對植物樣品所含的重金屬價態(tài)、元素構成、分子結構等采取分子或原子層面的檢測方式，與間接分析法相比無需分離樣品中重金屬，能夠準確分析重金屬實際結構、形態(tài)。目前主要有X射線吸收精細結構譜(XAFS)、X射線光電子能譜(XPS)、傅立葉變換紅外光譜(FTIR)等。表1對比介紹了常用的植物內(nèi)重金屬賦存形態(tài)分析方法。

表1 植物內(nèi)重金屬賦存形態(tài)分析方法Table 1 Analysis methods for heavy metal speciation in plants

1.1 間接分析法

1.1.1 化學提取

化學提取法按照提取次數(shù)可分為單級提取法和多級提取法。由于植物中重金屬的化學形態(tài)較為復雜，所以目前多級提取法在重金屬賦存形態(tài)上的使用更多[13]。多級提取法是利用選擇性依次增強的提取劑對顆粒樣品中不同理化性質(zhì)的重金屬元素進行分級提取的方法[14]。目前常用的化學提取法為Tessier法[15]及歐洲共同體參考物機構(BCR)的規(guī)定方法[16]，其他方法大多是在它們的基礎上進行優(yōu)化，表2簡要介紹了Tessier和BCR 2種方法所用的化學態(tài)、提取劑及提取條件。

表2 植物內(nèi)重金屬化學提取法Table 2 Chemical extraction methods of heavy metals in plants

馬榮輝等[17]進行黑土-水稻系統(tǒng)中銅形態(tài)研究時發(fā)現(xiàn)，土壤中Cu形態(tài)與植物內(nèi)Cu形態(tài)有顯著的相關性，通過施加豬糞能降低土壤中活性態(tài)Cu含量，使其由非結合態(tài)向結合態(tài)轉(zhuǎn)化，相應地植物內(nèi)水溶態(tài)、碳酸鹽提取態(tài)等植物可利用的Cu形態(tài)比例下降，其與土壤Cu變化呈現(xiàn)正相關。這說明植物內(nèi)重金屬形態(tài)與土壤重金屬具有相關性，可通過植物間接分析土壤重金屬污染種類及程度。傳統(tǒng)Tessier法存在提取劑缺乏選擇性、提取過程中有重吸附和再分配現(xiàn)象、缺乏統(tǒng)一標準分析方法、分析結果的可比性差等問題，導致實驗結果誤差大。針對上述問題，研究者從改良提取劑，采用準確度更高、更靈敏的檢測方法，對已有的幾種金屬形態(tài)進行進一步劃分等方面對其進行了改進。吳慧梅等[18]對茶葉中的6種金屬元素進行BCR三步簡化分析，將重金屬依次分為乙醇提取態(tài)、鹽酸提取態(tài)和殘渣態(tài)，實驗結果表明，3種形態(tài)的金屬含量之和占各元素總量的80%以上，回收率與標準偏差滿足形態(tài)分析的要求。但該方法也存在對金屬形態(tài)分類較為簡單、無法獲取更多的金屬形態(tài)信息、與其他方法所得結果難以進行比較等缺點。目前，對于化學提取法的研究主要集中于特異性提取劑的選擇、新分類方法的建立等方面。

1.1.2 色譜分離

為了更好更快地對植物中的金屬進行分類提取，有研究者借助分離器(如高效液相色譜、氣相色譜等)，利用不同形態(tài)金屬在色譜柱內(nèi)遷移能力的差異，實現(xiàn)金屬種類、形態(tài)的高效分離，然后采用原子吸收光譜法(AAS)、原子熒光光譜(AFS)、電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)等檢測儀，對分離后的金屬含量進行檢測。

色譜分離器-檢測器聯(lián)用技術較為靈活，可選擇的方式較多，目前沒有統(tǒng)一的聯(lián)用形式，但是高效液相色譜(HPLC)因其較強的分離能力常被用于分離裝置，而電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)因其較高的靈敏度與準確度、較低的檢出限等優(yōu)點常被用于檢測裝置。TIE[19]利用基于高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(HPLC-ICP-MS)對金針菇中的Se進行分析，對水溶性蛋白經(jīng)過提純后，結果表明存在至少6種含Se蛋白質(zhì)，占可溶Se總量的約7.0%。SANG等[20]利用HPLC-ICP-MS對水稻中的As進行檢測，結果表明主要含As(Ⅲ)，其次為As(Ⅴ)，含量最低的為有機As。除了高效液相色譜以外，還有人采用其他的分離方式，如SANTHA等[21]利用離子交換色譜作為分離裝置，采用ICP-MS作為檢測裝置對蕓薹葉中Se復合物形態(tài)進行研究，發(fā)現(xiàn)其主要以蛋氨酸-甲基硒和半胱氨酸-甲基硒形態(tài)存在，且后者含量較高。但是聯(lián)用技術方法本身也有局限性，它能對不同形態(tài)的重金屬進行分離，但不能給出重金屬化合物的結構信息，因此需與其他分析方法聯(lián)用(如電噴霧質(zhì)譜等)。

1.2 直接分析法

1.2.1 XAFS

XAFS通過對樣品的入射X射線吸收曲線上下波動產(chǎn)生的精細結構進行測定及計算，對原子的排列情況及周圍原子配位狀況等進行分析，從而分析其結構特征[22]。XAFS按能量范圍可分為擴展X射線吸收精細結構(EXAFS)和X射線吸收近邊結構(XANES)2個部分。EXAFS能反映吸收X射線原子的鄰近原子間距、種類和配位數(shù)等信息；而XANES能反映原子的化學價態(tài)和配位狀態(tài)[23]。

不同的元素有不同的吸收邊能量，且元素間干擾較小。因此，XAFS在土壤、植物等環(huán)境樣品的研究中顯示出獨特的優(yōu)勢，已被開始用于分析其重金屬分子形態(tài)。BLUEMLEIN等[24]對藤本植物根部As形態(tài)進行檢測，測得大部分As是As(III)，并與肽S(53%)結合形成As(III)-PC復合物。同時EXAFS數(shù)據(jù)也證實了As—S和As—O鍵的存在，推測這2種鍵是在植物中形成的，可能為植物緩解As毒性的機制之一。JIN等[25]對用As(Ⅴ)處理過的擬南芥進行檢測，測得擬南芥中出現(xiàn)As(Ⅲ)，并且與O、S配位，推測擬南芥可能在體內(nèi)將高毒性As(Ⅴ)轉(zhuǎn)化為毒性較低的As(Ⅲ)，并通過形成絡合物，緩解重金屬的毒性。XAFS因其具有靈敏性強、在不破壞樣品的情況下可進行原位測定、能準確分析金屬形態(tài)和結構等優(yōu)點，在植物中重金屬形態(tài)分析上具有獨特的優(yōu)越性。但是該法設備投資以及維護成本較高、操作較為復雜、需要利用已知結構的標準物質(zhì)確定化學鍵的結合形式或利用現(xiàn)有的同步輻射圖譜及數(shù)據(jù)庫資料進行分析，增加了未知樣品當中物質(zhì)形態(tài)監(jiān)測的難度。

1.2.2 XPS

XPS是根據(jù)光電效應對電子能量進行檢測的譜學技術。利用X射線轟擊樣品原子的內(nèi)層電子，使其處于激發(fā)態(tài)。當激發(fā)態(tài)電子能量高于真空能級就會逸出原子外，通過對光電子能量進行分析可以測出元素種類及其所處的化學環(huán)境，進而推測出該元素的化學結合狀態(tài)和價態(tài)[26]。

XPS可對元素化學態(tài)進行分析，從而分析出化合物組成，而且有檢測速度快、應用范圍廣、無需前處理等優(yōu)點。在植物生理學、分子生物學等方面均有良好應用。TAN等[27]對小麥莖內(nèi)鉛的化學形態(tài)進行分析，發(fā)現(xiàn)在小麥莖基部Pb2+主要與—COOH及—OH結合形成配位體，從而有較好的吸收性。斯冬芳[28]對三角褐指藻中Cd的絡合作用進行研究，發(fā)現(xiàn)細胞壁上—COOH、—OH和—NH2與Cd形成絡合物較多，從而減少細胞質(zhì)內(nèi)游離Cd的含量，推測這種細胞壁基團絡合作用與重金屬解毒機制有關。盡管XPS在植物樣品檢測上應用較多，但僅限于樣品表面10 nm范圍內(nèi)的元素，除此之外，樣品深層元素無法測出，高真空條件較難維持，靈敏度、精密度與空間分辨率較低，儀器成本昂貴等不足均使其應用受到一定限制。

1.2.3 FTIR

2 植物內(nèi)重金屬分布特征分析方法

重金屬在植物內(nèi)的分布，實質(zhì)上是指植物內(nèi)重金屬在不同部位的含量，其結果對于分析土壤或大氣環(huán)境重金屬污染的指示作用、揭示植物對重金屬脅迫的抗逆性信號機理、預測重金屬污染發(fā)展趨勢、研究植物耐受機制等方面提供數(shù)據(jù)基礎。表3對植物內(nèi)重金屬分布特征常用的分析方法(差速離心法、電鏡顯微技術、熒光探針)進行了簡要說明及比較[32-33]。

表3 植物內(nèi)重金屬分布特征分析方法Table 3 Analysis methods for heavy metal distribution characteristics in plants

2.1 差速離心法

差速離心法是對植物中重金屬在亞細胞水平上的分布特征進行分析的常用方法。其基本原理是先將含有提取緩沖液的樣本細胞打碎，根據(jù)不同細胞器的質(zhì)量差異，通過差速離心機分離亞細胞組分，將細胞分為細胞壁及殘渣、細胞核、線粒體及葉綠體等細胞器、可溶部分等組分，再分別對各組分進行檢測。MING[38]對蕓苔和小白菜釩的組織積累和亞細胞分布特征進行分析，結果顯示釩在細胞壁中含量最高，其次是可溶性部分，兩者之和占總量的90%以上。極端情況下，釩亞細胞分布在細胞核、線粒體和葉綠體(僅占總釩的6.8%)，表明細胞壁和可溶性部分是主要的釩累積位點。XIN等[39]對2個蘿卜品種中Cd的亞細胞分布進行了比較，發(fā)現(xiàn)Cd敏感基因型H 4中所有亞細胞組分的Cd濃度都高于Cd耐性基因型L 19，同時，大部分Cd分布于H 4根系細胞壁，而L 19根系Cd的2個品種的葉片中Cd主要貯藏在可溶性部分，推測這可能涉及耐Cd毒性機制。由于該方法具有儀器要求低、操作簡單、設備投入少、簡便快捷等優(yōu)點，當實驗室不具備掃描電鏡等顯微成像儀器時，為了分析植物對重金屬的解毒原理，可采用此法對重金屬亞細胞分布(細胞器水平)進行分析。但是由于該法對操作精確度要求較高、樣品處理效果直接影響實驗結果、不能以成像方式直觀觀察重金屬亞細胞分布特征、會對樣品細胞造成破壞等，限制了其在活細胞原位檢測的使用。

2.2 電鏡顯微技術

電子顯微鏡是利用電子源發(fā)出的電子轟擊樣品，電子與物質(zhì)發(fā)生作用從而發(fā)生二次電子、透射電子、俄歇電子、X射線等信號，然后對這些信號及逆行分析，從而觀察樣品區(qū)域結構、物質(zhì)組分、電子分布等情況的電子光學裝置[40]。按結構和用途可分為透射式電子顯微鏡(TEM)、掃描式電子顯微鏡(SEM)、反射式電子顯微鏡和發(fā)射式電子顯微鏡等。電鏡只能將樣品進行顯微成像，還需借助光譜技術將樣品組分中重金屬含量測定出來，兩者結合就能將樣品中重金屬在不同位置的含量顯示出來，即觀察重金屬的分布特征，而X射線能量色散光譜儀(EDX)是其中最常用的光譜技術。

在對植物中重金屬進行細胞層面的分布特征分析時，為了直觀地觀察到重金屬的分布情況，電鏡通常與EDX聯(lián)用。EDX本質(zhì)上也是借助測定樣品受X射線激發(fā)時所發(fā)出的特征X射線波長和強度，對元素進行定性、定量測定。LU等[41]利用SEM-EDX測定紅樹中Cu、Zn、Pb和Cd的細胞分布和化學形態(tài)，結果表明，Cd主要分布在表皮、皮層、內(nèi)皮層和一些木質(zhì)部薄壁的壁上，其他金屬也呈現(xiàn)類似的分布趨勢，且Cd濃度在表皮細胞最高，細胞壁濃度大于細胞間隙濃度。推測根表皮是金屬運輸?shù)闹饕系K，與紅樹植物的耐受機制有關。但是該法也有不足之處，例如普通電鏡只能提供瞬時的二維圖像，難以觀察樣品三維立體結構，樣品操作條件需保持真空等問題。因此學者在普通掃描電鏡的基礎上開發(fā)了掃描探針顯微鏡(SPM)、激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)等技術。這些技術以激光為光源，將掃描電鏡與熒光技術相結合，對樣品掃描的分辨率、靈敏度等提供更好的成像條件，同時也可以對樣品的三維結構進行實時檢測。張衛(wèi)娜等[42]采用LSCM對受Cd脅迫的擬南芥根細胞進行觀察，對于Cd在根中亞細胞分布的觀察取得了良好的實驗效果。但由于此技術發(fā)展較晚、設備成本較高、操作較為復雜，需使用具有一定質(zhì)量要求的熒光探針進行標記再掃描成像，所以掃描速度受到限制，檢測效率較其他顯微技術略低，但隨著激光光源、檢測器等方面的研究，該項技術的應用前景仍十分廣闊。

2.3 熒光探針標記

熒光探針標記是指利用強熒光的標記試劑對待測物進行標記，生成具有高熒光強度的結合物，根據(jù)探針種類、熒光強度對待測物質(zhì)進行定性定量分析[43]。熒光探針分子通常由識別基團、熒光基團、連接體部分3個部分組成[44]。按熒光探針物質(zhì)本身的性質(zhì)將其分為有機物探針、納米材料探針、蛋白探針等。對重金屬的檢測主要采用熒光素類、羅丹明類、香豆素類等化合物。

熒光探針靈敏性高、無需預處理即可對活細胞進行原位檢測、選擇性好(熒光探針可設計性強，根據(jù)被測物的種類和結構，能對探針形態(tài)及結構進行設計)，現(xiàn)在植物活細胞中重金屬分布檢測的應用越來越多。姚宏偉等[45]采用Zn特異性探針HL 1對擬南芥和谷子中的Zn進行檢測時，發(fā)現(xiàn)在擬南芥中Zn2+主要分布于細胞間隙以及葉表皮毛的外周和表層；而谷子葉片中的Zn2+分布在細胞間隙以及維管組織中較多，且熒光強度與濃度表現(xiàn)出正相關。JI等[46]采用一種高選擇性的“開啟”熒光探針在其他金屬離子的干擾下測定擬南芥中Zn2+，結果顯示此探針靈敏度達到3.2×10-12，且Zn2+主要被隔離在擬南芥的液泡中，熒光強度表現(xiàn)強烈。盡管熒光探針在活細胞金屬分布檢測上具有明顯的優(yōu)勢，但該法尚有不足，比如探針分子在活細胞中的均勻分布是最大難點之一，而且當細胞中含有色素時會對熒光產(chǎn)生干擾，需要提前對樣品進行脫色處理，這些缺點限制了其應用。

2.4 X射線熒光(XRF)

XRF分析是指利用激發(fā)光源發(fā)出的初級X射線轟擊被測樣品中基態(tài)原子，當被X射線激發(fā)時，基態(tài)原子的內(nèi)層電子會向外層躍遷從而掙脫原子核的束縛，而電子躍遷產(chǎn)生的空位將由外層電子填補，電子從高能態(tài)躍遷到低能態(tài)會損失能量，從而使原子在特定的能量下發(fā)出熒光[47]。XRF分析在環(huán)境樣品的檢測方面已趨于成熟，另外因其檢出限低、靈敏度高、可對樣品進行原位檢測、無需前處理且可同時對多元素進行分析等特點，目前在植物樣品重金屬分布檢測上應用較多。王君玲等[48]利用微束X光對大米中的P、Cl、K、Ca、Fe、Cu、Zn元素進行掃描時發(fā)現(xiàn)前4種元素主要集中在大米的胚芽處，而后3種元素分布較為均勻，其含量自胚芽至整個胚乳呈遞減趨勢。可見XRF分析在植物樣品重金屬微區(qū)分布檢測上有著良好應用。但由于普通XRF分析自身具有局限性(如常規(guī)射線源強度不夠造成檢出限較低、光線空間分布不均勻使得空間分辨率較低等問題)，限制了它對痕量重金屬微區(qū)分布的檢測。

為了提高檢出限以及空間分辨率，有人采用同步輻射裝置作為激發(fā)光源，利用帶電粒子在同步加速器中做變速運動時產(chǎn)生的電磁輻射作為激發(fā)光源對樣品進行分析。THOMAS等[49]采用同步輻射光源激發(fā)豇豆幼苗根部的As，發(fā)現(xiàn)As在根尖的分生組織含量最高，其次是根的邊緣細胞及內(nèi)皮層，推測As的積累導致分生組織的永久性損傷，并通過邊框細胞積累高濃度的As限制其運動，從而使豇豆對As具有一定的耐受性。陳璐等[50]利用SR-XRF對植物三七根部As進行細胞層面分布特征的檢測，實驗發(fā)現(xiàn)三七根部中的As主要分布于表皮細胞，并且有向維管組織運輸?shù)内厔?。當濃度大?0 mg/L時，會使根部腐爛從而造成植物死亡。實驗結果表明SR-XRF在細胞層面上對植物中重金屬分布特征進行檢測取得了良好的實驗結果。與其他XRF分析相比其區(qū)別在于，SR-XRF是采用電磁輻射作為激發(fā)光源而非同位素放射源。因此同步輻射具有光通量大、頻譜寬、分析速度快、偏振性好等優(yōu)點。但是該裝置具有價格昂貴、操作復雜、光源容易受環(huán)境條件影響等缺點。

3 展望

植物能夠直觀反映受損生態(tài)系統(tǒng)對環(huán)境脅迫因子的綜合響應，對于研究重金屬污染的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律及其對生態(tài)系統(tǒng)的長期影響具有特殊優(yōu)勢。植物監(jiān)測在現(xiàn)代環(huán)境污染預警與治理等方面的作用已引起廣泛關注。隨著現(xiàn)代分析儀器的發(fā)展，儀器對植物中重金屬的賦存形態(tài)及分布特征分析方法的靈敏度及準確度也不斷提高，針對現(xiàn)有植物樣品重金屬信息分析方法的特點，未來發(fā)展方向包括以下3個方面：

1)目前對于植物內(nèi)重金屬的檢測尚未建立國家標準，這在很大程度上影響了實驗數(shù)據(jù)的準確性及可比性，因此建立以兼顧統(tǒng)一性及可靠性分析檢測方法為主體的強制性標準和推薦性標準，提高分析設備的自動化程度，實現(xiàn)樣品的快速、批量測定，降低測定成本，開發(fā)更加完善、簡便的新分析方法十分必要。

2)由于植物往往表現(xiàn)出對區(qū)域內(nèi)所有污染物的綜合響應，因此，如何從植株個體、器官、組織、細胞及細胞器水平加深植物與重金屬在環(huán)境中遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律的相關性及互作機制的研究，對于促進植物監(jiān)測技術的成熟具有重要意義。

3)對不同地區(qū)植物內(nèi)重金屬形態(tài)、分布特征進行調(diào)查，通過互聯(lián)網(wǎng)建立數(shù)據(jù)共享平臺，解析當?shù)刂亟饘傥廴境潭?、種類及來源，有助于及時豐富重金屬污染指示植物及修復植物的種類庫，構建合理的污染預防及修復方案。