杜家穎，涂成龍，盛茂銀，崔麗峰，陳琢玉，張林楷

（1.貴州師范大學喀斯特研究院，貴陽 550001；2.中國科學院地球化學研究所環(huán)境地球化學國家重點實驗室，貴陽 550002；3.開陽縣國土資源局，貴州開陽 550308）

土壤微生物是土壤中重要的活體成分，也是土壤性質的重要指標[1]。磷脂脂肪酸（PLFA）是微生物細胞膜的主要成分，對微生物群落結構具有一定的指示作用[2-3]。土壤微生物群落結構和活性是土壤生物過程中重要的限制因子，且在很大程度地決定了生物地球化學循環(huán)、土壤肥力、土壤質量以及土壤有機碳的循環(huán)過程[4]。細菌、真菌、放線菌等微生物的比率也是反映土壤肥力狀況的重要指標[5]。因此，磷脂脂肪酸在生態(tài)學、地球化學等學科研究中被廣泛用作生物標志物以指示元素循環(huán)方向和速率、植被演化過程[6-7]。

土壤中的微生物以其豐富的生物多樣性使它們成為生態(tài)系統(tǒng)中最活躍和最具影響力的組分之一[8]。幾乎上所有的土壤生態(tài)過程中都直接或間接與土壤微生物相關。在過去的微生物研究中，多依賴于傳統(tǒng)的方法對土壤微生物進行分析，但是傳統(tǒng)方法能夠分離鑒定到的微生物只占土壤微生物總數(shù)的0.1%～1%[9]。用磷脂脂肪酸研究方法不僅可以檢測樣品中60%的微生物量，而且能增加實驗數(shù)據(jù)的準確性。因此，PLFA法被廣泛地運用于鑒別土壤微生物群落結構和生物總量的研究中。

隨著人類社會經(jīng)濟活動對自然生態(tài)系統(tǒng)不斷影響，土壤微生物顯得尤為重要，利用PLFA分析方法研究土壤微生物是當今熱點之一[10]。目前，單一研究不同土地利用方式對土壤理化性質、生態(tài)化學計量學、微生物群落結構的影響較多，而運用PLFA方法來研究土地利用方式轉變對于土壤微生物數(shù)量、活性、結構的影響相對較少[11-12]。因此，本研究選取林地、農(nóng)用地、撂荒地3種具有明顯關聯(lián)性的土地利用方式，運用PLFA方法研究土地利用方式轉變對土壤微生物活性、數(shù)量、以及群落結構的影響，為研究區(qū)提高、檢測土壤肥力，并合理地可持續(xù)利用土地資源提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于貴州省畢節(jié)市黔西縣新仁苗族鄉(xiāng)，中心點坐標為（東經(jīng) 105°47′～106°26′、北緯 26°45′～27°21′間），屬于云貴高原東部脊狀斜坡南側向廣西丘陵傾斜的斜坡地帶，總面積68.9 km2。地貌類型為典型的喀斯特高原峽谷，地勢起伏大，類型復雜多樣，碳酸鹽巖分布廣泛。多年平均氣溫14.2℃，最低月平均氣溫3.3℃（1月），最高月平均氣溫23℃（7月），極端最高氣溫35.4℃，降雨量1 087.5 mm、日照時長1 066.9 h、無霜期271 d。林地沒有經(jīng)過人為干擾，以灌木、草木為主；農(nóng)用地中以玉米和油菜輪作為主；撂荒地撂荒時間在6年以上，以雜草為主。3個樣點同屬一塊坡面斜坡地帶，主要區(qū)別僅為土地利用方式不同。因此，本研究應用空間代替時間的方法，將其視為土地利用方式轉變的3種形態(tài)。

1.2 土壤理化性質測定

2017年6月，在3種不同土地利用類型下各設置3個隨機分布的重復取樣點，用土鉆采集器分別采集 0～20、20～60和 60～100 cm 深度的土壤。采集回來的土樣，除去其中的細根、礫石等雜質后，分2份儲存。一份經(jīng)過冷凍干燥，過2 mm篩，用于土壤微生物分析。另一份則風干磨碎后用于土壤基本理化性質測定。土壤pH采用pH計測定，水土比為1∶2.5；土壤有機質采用硫酸重鉻酸鉀氧化—外加熱法測定[13]107、全氮采用半微量開氏法—流動注射儀測定[13]147、全磷采用NaOH熔融-鉬銻抗顯色—紫外分光光度法測定[13]168。

1.3 土壤微生物PLFAs分析[14]

在野外采集土壤樣品，帶回實驗室進行冷凍干燥后，取15 g準備好的土樣（干重）置于50 mL離心管中，加15 ml 0.2 mol/L的KOH-甲醇溶液，振蕩5 min后，放入37℃水浴1 h（期間每10 min振蕩1次）。取出后加入3 ml 1.0 mol/L的醋酸溶液中和，充分搖勻后，再加10 mL正己烷，充分搖勻。放入離心機中離心15 min后，取上層液體于玻璃試管中，氮氣吹干使溶劑揮發(fā)。然后在玻璃試管中加入0.5 mL體積比為1∶1的正己烷甲基丁基醚溶液，充分溶解3～5 min，轉入GC小瓶，同時加入10 mL濃度為1 mg/mL的內標，上機GC儀器進行測定。所用有機溶劑均為色譜純。

1.4 土壤微生物群落PLFA的標記分析與含量測定

現(xiàn)將目前已鑒定認同對細菌、真菌、嗜熱解氫桿菌、革蘭氏陰性細菌具有指示意義的PLFA列入表1。

表1 表征土壤微生物的PLFATable1 PLFA characterizing soil microbes

1.5 統(tǒng)計分析

采用Excel 2010、SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，用主成分分析法PCA（principal component analysis）對磷脂脂肪酸數(shù)據(jù)進行分析。采用SPSS22.0對不同土地利用類型下土壤C、N含量以及C/N的差異進行分析。

2 結果和分析

2.1 土地利用轉變對土壤理化性質的影響

依據(jù)空間換時間的方法，本研究假定林地-農(nóng)用地-撂荒地為同一序列的不同時間段。從表2可知，當林地轉化為農(nóng)用地后，表層、中層、深層土壤pH值均有明顯升高現(xiàn)象，且達到了顯著水平（P＜0.05）。表層有機質的含量水平?jīng)]有顯著變化，中層、深層土壤中有機質的含量有明顯降低現(xiàn)象，且達到了顯著水平（P＜0.05）。由于人為氮肥的施入，表層、中層農(nóng)用地表層土壤的氮含量顯著高于林地，且達到了顯著水平（P＜0.05）；深層受到施肥的影響較小，從而深層農(nóng)用地土壤的氮含量顯著低于林地，且達到了顯著水平（P＜0.05）。這進而引起了碳氮比發(fā)生顯著變化，表層、中層林地土壤的C/N顯著高于農(nóng)用地，且達到了顯著水平（P＜0.05）；深層林地、農(nóng)用地的土壤C/N無顯著變化。

表2 3種不同土地利用方式下農(nóng)田土壤的基本性質Table2 Basic soil properties under three different land use patterns in farmland soils

當農(nóng)用地被廢棄成為撂荒地后，表層、中層土壤pH有明顯降低，且達到了顯著水平（P＜0.05）；深層土壤pH有明顯升高，且達到了顯著水平（P＜0.05）。表層有機質的含量水平有明顯降低，且達到了顯著水平（P＜0.05）；中層、深層土壤有機質的含量水平有明顯升高，且達到了顯著水平（P＜0.05）。表層農(nóng)用地土壤的氮含量顯著高于撂荒地；中層農(nóng)用地土壤的氮含量顯著低于撂荒地；深層農(nóng)用地、撂荒地的土壤的氮含量無顯著變化。這進而引起了碳氮比發(fā)生顯著變化，表層碳氮比沒有發(fā)生顯著變化；中層、深層碳氮比發(fā)生顯著變化，農(nóng)用地低于撂荒地，且達到了顯著水平（P＜0.05）。

2.2 土壤微生物的PLFA種類和總量比較

從表3可知，就PLFAs總量而言，在0～20 cm土壤中，林地顯著高于農(nóng)用地和撂荒地，農(nóng)用地與撂荒地無顯著變化。在20～60 cm土壤中，林地顯著高于農(nóng)用地和撂荒地，農(nóng)用地顯著高于撂荒地。在60～100 cm土壤中，林地顯著高于農(nóng)用地和撂荒地，農(nóng)用地與撂荒地無顯著變化。有9種PLFA在3種不同土地利用方式的土壤中均有出現(xiàn)。細菌中，C16：0含量均高于 C15：0、C20：0 細菌含量；真菌中，C18：2n6c含量高于 C18：1n9c、C18：3n6c、C18：3n3。細菌、真菌、革蘭陰性菌、嗜熱解氫桿菌中林地含量都顯著高于撂荒地和農(nóng)用地，且真菌中的C18：3n3生物標記只在0～60 cm的土層分布?？偟腜LFA而言，林地顯著高于農(nóng)用地和撂荒地，且0～20 cm的土層包含了60%的微生物群落，農(nóng)用地與撂荒地無顯著變化。這也說明了林地轉變?yōu)檗r(nóng)用地伴隨著微生物群落的降低，而撂荒地則與農(nóng)用地的變化相差不大，這可能是撂荒時間較短的原因。

表3 不同植被群落土壤微生物PLFA的類型及含量Table3 Types and contents of PLFA in soils of different land use patterns

2.3 不同土壤深度的土壤微生物群落組成比較

在3種不同土地利用類型中，代表細菌、真菌、革蘭陰性菌、嗜熱解氫桿菌的PLFAs含量分別為0～20＞20～60＞60～100 cm；且隨著深度的增加，PLFAs含量逐漸減少（圖1）。在林地中，0～20 cm土壤的細菌、真菌、革蘭陰性菌、嗜熱解氫桿菌都顯著地高于20～60、60～100 cm；20～60 cm 除革蘭陰性菌以外，細菌、真菌、嗜熱解氫桿菌含量顯著高于60～100 cm。在農(nóng)用地中，0～20 cm土壤的細菌、真菌、革蘭陰性菌、嗜熱解氫桿菌都顯著地高于20～60、60～100 cm；20～60和60～100 cm除革蘭陰性菌以外，細菌、真菌、嗜熱解氫桿菌含量無顯著差異。在撂荒地中，0～20 cm土壤的細菌、真菌、革蘭陰性菌、嗜熱解氫桿菌都顯著高于 20～60、60～100 cm；20～60 和 60～100 cm 的細菌、真菌、革蘭陰性菌、嗜熱解氫桿菌含量無顯著差異。

2.4 不同土地利用方式下土壤微生物PLFA主成分分析

應用主成分分析法的思路對土壤PLFAs的進行分析，共提取 6 個主成分，分別是 C16：0 X1，C18：2n6c X2，C16：1n9c X3，C18：0 X4，C22：2 X5，C17：1 X6。使用統(tǒng)計軟件SPSS計算，得出特征值、主成分貢獻率與累計貢獻率。從表4和表5可以看出主成分有6個最大的特征值，即 5.724，2.559，2.064，1.561，1.487，1.165，第一、第二、第三、第四、第五、第六主成分的累積貢獻率己達76.629%。這說明前6個主成分提供了足夠的原始數(shù)據(jù)信息，完全符合分析的要求。結果表明，細菌、真菌、革蘭氏陰性菌和嗜熱解氫桿菌PLFAs含量在土壤微生物中占主導地位，是影響土壤生物群落的主要成分之一。

2.5 不同土地利用方式下土壤理化性質與微生物PLFA相關性

從表6可知，細菌、真菌、革蘭氏陰性菌和嗜熱解氫桿菌PLFAs含量與土壤有機碳在0.01置信水平下呈顯著正相關；與pH、全氮含量呈負相關關系；與C/N呈正相關關系。

3 討論

3.1 土壤理化性質對PLFA的影響

植物養(yǎng)分的主要來源是土壤，不同的生態(tài)環(huán)境、土地利用方式都會引起土壤生態(tài)過程的變化以及土壤C、N含量、PLFA的差異。研究區(qū)林地的土壤有機碳、全氮、碳氮比均大于撂荒地和農(nóng)用地，表明在人為干擾情況下，撂荒地和農(nóng)用地的土壤性質有所下降，土壤養(yǎng)分發(fā)生明顯退化，這與蘭志龍等[20]的研究結果類似。土壤微生物群落的多樣性與土壤理化性質息息相關，是土壤養(yǎng)分、凋落物和根系分泌物等因素共同作用的結果，反映了土壤理化性質與土壤微生物之間的密切關系[21]。

3.2 不同土地利用方式轉變下對微生物的影響

土壤微生物多樣性是反映生態(tài)系統(tǒng)受干擾后細小變化的重點監(jiān)測因子，它可以描述微生物群落變化、微生物群落生態(tài)學機理以及自然或人為干擾對群落的影響[22]。不同土地利用方式是影響土壤微生物群落結構差異最主要的因素之一。植被類型與管理制度的不同是引起土壤微生物群落變化的主要因素，選用林地、農(nóng)用地、撂荒地3種不同土地利用方式，間接地反映了林地轉化為農(nóng)用地，農(nóng)用地轉化成撂荒地的結果。張娣等[23]的研究也顯示，耕作下的土壤、退耕還草土壤、原生態(tài)土壤3種不同土地利用方式下土壤微生物群落結構中優(yōu)勢菌群有差異。劉明等[24]研究不同農(nóng)林利用方式下紅壤微生物生物量和代謝功能多樣性等土壤質量指標的變化，結果表明紅壤地區(qū)不同利用方式能對土壤微生物生物量及群落結構產(chǎn)生影響。本研究與張娣等[23-24]的研究結果類似。田倩等[25]研究表明，植被類型對微生物群落的影響，目前集中于植被群落的多樣性、不同植被的根際、根系以及同一植物不同基因型間或不同根區(qū)、根際對土壤微生物群落影響方面的研究。本文研究結果表明，不同土地利用方式下的PLFAs含量表現(xiàn)為細菌＞真菌＞革蘭氏陰性菌＞嗜熱解氫桿菌，而細菌、真菌在林地、農(nóng)用地、撂荒地中占主導地位，這主要是由于在采樣期間在6月份，濕度與溫度有利于細菌的生長。從研究中可以看出，PLFAs含量表現(xiàn)為林地＞農(nóng)用地＞撂荒地，這是由于植被類型決定的。在林地中，植被群落較為復雜，而農(nóng)用地、撂荒地植被相對單一，則PLFAs含量較少，且隨著土壤深度的增加，微生物含量呈下降的趨勢。

圖1 不同土壤剖面的磷脂脂肪酸總量以及細菌、真菌、革蘭陰性菌、嗜熱解氫桿菌的PLFA含量Figure1 Total PLFA，PLFA contents characterised by bacteria，fungi，gram-bacteria，hydrogenobater in different soil profiles

表4 土壤微生物PLFA的特征值和主成分累計貢獻率Table4 The characteristics of soil microbial PLFA and the cumulative contribution rate of principal components

表5 土壤微生物PLFA的主成分載荷矩陣Table5 The principal component load matrix of soil microorganism PLFA

表6 土壤微生物指標與土壤理化性質的相關分析Table6 Pearson correlations coefficients between microbial variables and soilphysico-chemical characteristics

3.3 不同土壤層次對微生物的影響

對影響土壤的驅動因子進行定量分析，以便進一步探討微生物和土壤之間的相互關系。不同土地利用類型下的PLFAs種類有很多，這些PLFAs因素不僅與因變量-不同土地深度之間存在著相關關系，而且相互之間還存在耦合關聯(lián)；影響土壤微生物群落的其中一個因素是土壤結構，土壤結構相似，則微生物群落結構也相似，但不同土地方式下，微生物群含量也隨之變化。本研究中表示，細菌、真菌、革蘭氏陰性菌、嗜熱解氫桿菌的PLFAs在土壤中占主導地位，且隨著深度的增加而呈現(xiàn)遞減趨勢。細菌、真菌、革蘭氏陰性菌、嗜熱解氫桿菌越多，則表示土壤肥力越強；嗜熱解氫桿菌在一定深度后，其減少的趨勢相對不明顯，但是在土壤微生物群落中是不可缺少的一部分。在土壤表層0～20 cm的土層中，集中了60%以上的土壤微生物，20～60 cm和60～100 cm土層的微生物數(shù)量相差不大，雖然有下降的趨勢，但不是很明顯，這與劉海燕[26]的研究類似。

3.4 土壤理化性質與PLFA間的相關性

根據(jù)Pearson相關系數(shù)分析，上述5個指標（PLFAs總量、細菌、真菌、革蘭氏陰性菌、嗜熱解氫桿菌的PLFAs）與土壤C含量呈正相關，與N含量呈負相關，但是與N含量相關性不大，這表明不同土壤的土壤微生物受到C含量變化的影響[26-27]。A.Sessitsch等[28]對長期不同施肥條件下土壤顆粒中的微生物群落結構進行分析，結果表明在同一粒徑下，有機質含量越高，微生物多樣性越豐富，即土壤有機質含量會顯著影響土壤微生物的群落結構。研究表明，土層0～20 cm的土壤PLFAs高于土層20～60 cm、60～100 cm的土壤PLFAs，林地的土壤PLFAs高于農(nóng)用地和撂荒地的土壤PLFAs，且都與有機碳含量和C/N呈現(xiàn)正相關關系，這就說明了土壤PLFA的豐富度、多樣性指數(shù)都與土壤質地密切相關，而PLFA是微生物細胞的主要成分，說明土壤微生物的豐富度、多樣性與土壤質地密切相關。C.Kramer等[9]用PLFA方法分析自然狀況下以及添加石灰后的森林土壤微生物群落變化情況，結果表明，pH的變化對微生物有影響，而研究中，PLFA總量、細菌、真菌、革蘭氏陰性菌、嗜熱解氫桿菌的PLFA與pH呈現(xiàn)不顯著負相關關系，這與C.Kramer等[9]的研究結果有出入。