李 銳，任丹丹，周建瑜，符華林，劉 暢，申 蕓，凡國(guó)慶

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130）

妥曲珠利（toltrazuril）屬于三嗪酮類衍生物，是一種廣譜抗球蟲(chóng)藥物，對(duì)巨型、布氏和柔嫩等6種艾美爾球蟲(chóng)都有較強(qiáng)的殺滅作用，廣泛用于家禽和哺乳動(dòng)物球蟲(chóng)病的防治。妥曲珠利臨床主要以溶液劑和粉散劑為主[1]，由于妥曲珠利在水中不溶（25℃溶解度為0.41 μg/mL），在胃腸道中的吸收較差，因此限制了臨床中的應(yīng)用。為了增加妥曲珠利的溶解度，相繼有妥曲珠利納米乳[2]、環(huán)糊精包合物[3]和固體分散體[4]等報(bào)道，有人還研制了妥曲珠利口服溶液[5]，但溶劑為聚乙二醇和丙二醇等，有機(jī)溶劑的安全性限制了其使用。這些新劑型雖然在一定程度上改善了藥物的溶解度，但納米乳和固體分散體的穩(wěn)定性存在質(zhì)疑，環(huán)糊精載體材料比較昂貴，這給妥曲珠利的推廣應(yīng)用帶來(lái)影響。

納米膠束是表面活性劑分子聚集形成的納米聚集體，具有載藥量高、粒徑小和抗生理稀釋作用強(qiáng)等特點(diǎn)，且膠束中的表面活性劑單體對(duì)口服藥物具有吸收促進(jìn)作用，因而在藥物口服劑型中應(yīng)用廣泛。復(fù)合納米膠束是通過(guò)兩種或者多種具有協(xié)同作用的表面活性劑進(jìn)行復(fù)配的新型膠束，其在改善難溶性藥物溶解度、改變藥物的藥代動(dòng)力學(xué)特性、增加藥物在膠束中的穩(wěn)定性以及減少表面活性劑用量等方面具有更加明顯的優(yōu)勢(shì)，其中應(yīng)用較為成熟的復(fù)配體系是磷脂/膽鹽復(fù)合納米膠束[6-7]，其生物相容性較好，毒性較低，且能顯著提高一部分難溶性藥物的溶解度和生物利用度，但由于磷脂和膽鹽的成本較高，限制了其在獸藥制劑中的應(yīng)用。因此研制新型妥曲珠利納米膠束對(duì)于改善妥曲珠利在球蟲(chóng)病防治中的效果具有重要意義。

1 材料

1.1 藥品與試劑

妥曲珠利（含量≥99.0%）、脫氧膽酸鈉（NaDC,含量為98%）和Brij C20聚乙烯醚（Brij 58）由上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產(chǎn)；藥用級(jí)泊洛沙姆188（KolliphorR，P188）、藥用級(jí)泊洛沙姆407（LutrolRF127）和聚乙二醇單硬脂酸酯由巴斯夫中國(guó)有限公司生產(chǎn)；色譜甲醇（含量≥99.9%）、色譜乙腈（含量≥99.9%）和分析純乙腈（含量≥99.5%）由天津科密歐有限責(zé)任公司生產(chǎn)；曲拉通x100（Tx100）由成都科龍化工試劑廠生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

LC2010型高效液相色譜儀，島津國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；JJ24BL型電子分析天平，常熟市雙杰試劑儀器廠；Millipore超純水系統(tǒng)，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

2 方法

2.1 妥曲珠利復(fù)合納米膠束的制備

稱取妥曲珠利、NaDC、Tx100和Brij58適量，采用適量有機(jī)溶劑溶解藥物和輔料，混合均勻后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上將有機(jī)溶劑蒸發(fā)完，再將樣品置于真空干燥器中過(guò)夜干燥，然后進(jìn)行水化得到載藥復(fù)合納米膠束溶液，最后凍干即得妥曲珠利復(fù)合納米膠束凍干粉。

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

以載藥量和包封率為指標(biāo)，考察Brij 58、Tx100、脫氧膽酸鈉、投藥量、水化體積對(duì)載藥量和包封率的影響。

2.1.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)之上，采用響應(yīng)面法考察影響較大的5個(gè)因素脫氧膽酸鈉用量（mg）、Tx100用量（mg）、Brij 58 用量（mg）、水化體積（mL）和投藥量（mg）對(duì)妥曲珠利復(fù)合納米膠束的影響，因素水平表見(jiàn)表1，并按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 因素水平表Table1 Levels of factors

2.2 載藥量和包封率測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[8]進(jìn)行改進(jìn)建立了妥曲珠利的含量測(cè)定方法，色譜條件：流動(dòng)相為甲醇-0.1%的磷酸溶液（84∶16，v∶v），檢測(cè)波長(zhǎng)為 240 nm，柱溫為 25 ℃，流速為1.0 mL/min，結(jié)果表明該方法用于測(cè)定妥曲珠利的含量具有較高的專屬性，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=49 925×C+18 139（R2=0.999 9），在所測(cè)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，且具有較高的回收率，精密度實(shí)驗(yàn)中的RSD值均小于5%，符合藥物含量測(cè)定的規(guī)定。

精密吸取載藥膠束1 mL，加入3 mL乙腈，渦旋震蕩2 min，0.45 μm微孔濾器過(guò)濾后，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算妥曲珠利的含量。同法測(cè)定妥曲珠利原料藥在水中的質(zhì)量。載藥量和包封率的計(jì)算公式如式（1）、（2）：

其中，ms為妥曲珠利膠束溶液中藥物的質(zhì)量，mw為妥曲珠利在水中的質(zhì)量，mm為載體材料的質(zhì)量，mi為妥曲珠利投藥量。

本實(shí)驗(yàn)在單因素和優(yōu)化設(shè)計(jì)的過(guò)程中采用綜合評(píng)分法[9]，計(jì)算方法如式（3）：

其中，di為指標(biāo)的分值，Yi為實(shí)測(cè)值，Ymax和Ymin分別為各指標(biāo)的最大值和最小值，各指標(biāo)分值的平均值可作為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，其值越大，表明該處方和工藝越優(yōu)。

2.3 復(fù)合納米膠束對(duì)妥曲珠利增溶效果

將過(guò)量的復(fù)合納米膠束凍干制劑樣品加入適量的超純水中，置于37℃水浴振蕩器中振搖36 h，取樣，微孔濾膜過(guò)濾，測(cè)定藥物含量并計(jì)算其飽和溶解度。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 Brij 58用量的選擇

由表2可知，隨著B(niǎo)rij 58用量的增加，載藥膠束的包封率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，這可能是由于Brij58用量增加時(shí)水化過(guò)程中易發(fā)生自聚集，使得其包裹妥曲珠利的效率降低。

表2 Brij 58用量對(duì)載藥膠束的影響Table2 Effects of Brij58 dosage on drug loaded micelles

3.1.2 Tx100用量的選擇

Tx100用量對(duì)結(jié)果的影響見(jiàn)表3，由表3可知，隨著Tx100用量的增加，載藥膠束的包封率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，這是因?yàn)門(mén)x100濃度過(guò)大也會(huì)導(dǎo)致Tx100的迅速自聚集，從而導(dǎo)致包封率減小，包封率大幅度變化也會(huì)導(dǎo)致載藥量的不規(guī)律變化。

表3 Tx100用量對(duì)載藥膠束的影響Table3 Effects of Tx100 dosage of drug loaded micelles

3.1.3 NaDC用量的選擇

由表4可知，NaDC用量的波動(dòng)對(duì)包封率的影響較小，而對(duì)載藥量的影響較大，這可能是因?yàn)镹aDC為小分子表面活性劑，其疏水端與親水端均較短，若用量增大形成的自聚集體易發(fā)生解離，導(dǎo)致載藥量減小。

表4 NaDC用量對(duì)載藥復(fù)合納米膠束的影響Table4 Effects of NaDC of drug loaded micelles

3.1.4 投藥量的選擇

由表5可知，包封率隨投藥量的增加逐漸減小，當(dāng)投藥量大于10 mg時(shí)，包封率迅速減小，這是由于表面活性劑所形成的膠束的載藥能力有限，投藥量的過(guò)大會(huì)使得復(fù)合膠束的包裹效率大大降低，大部分藥物沉淀形成晶核，不易被膠束包裹。

表5 投藥量對(duì)載藥復(fù)合納米膠束的影響Table5 Effects of the dosage of the drug loaded nano-micelles

3.1.5 水化體積的選擇

由表6可知，隨著水化介質(zhì)用量的增加，膠束的載藥量和包封率逐漸遞減，這是因?yàn)樗w積太少時(shí)，膠束溶液在轉(zhuǎn)移過(guò)程中損失的量就很大使得包封率和載藥量變小，但當(dāng)水化介質(zhì)的用量為5 mL時(shí)包封率達(dá)到96.33%，再增加水相體積盡管包封率略有增加，但載藥量不變。

3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)

各因素和水平對(duì)載藥量和包封率的綜合影響見(jiàn)表7。利用Design Expert 8.06軟件對(duì)所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析。得到綜合評(píng)分值（d）對(duì)NaDC（A）、Tx100（B）、Brij58（C）、水體積（D）和投藥量（E）的二次多項(xiàng)回歸模型為：d=0.58-0.023A-7.687×10-3B-0.026C+0.012D+0.14E+0.016AB-1.605×10-3AC+0.023AD+0.067AE+0.042BC-0.013BD+0.030BE+0.017CD+0.11CE+0.027DE-0.057A2+0.011B2-0.011C2-0.024D2-0.069E2。

表6 水化介質(zhì)體積對(duì)載藥復(fù)合納米膠束的影響Table6 Effects of the volume of the hydration medium on the drug loaded nano-micelles

響應(yīng)面的回歸分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8，對(duì)各項(xiàng)方差來(lái)源進(jìn)行F檢驗(yàn)，結(jié)果表明模型的F值為32.77，P＜0.01表明該模型極顯著，不同處理之間差異顯著，模型相關(guān)系數(shù)R2為0.963 3，說(shuō)明此模型與試驗(yàn)結(jié)果吻合度較高。試驗(yàn)失擬項(xiàng)小說(shuō)明試驗(yàn)方法可靠能夠很好地描述試驗(yàn)結(jié)果，使用該方程代替真實(shí)的試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析是可行的。由表8可知，5個(gè)因素中，A、C和E的影響差異極顯著，因素之間的交互作用中，其交互作用效應(yīng)圖見(jiàn)圖 1，AE（如圖 1（a））、BC（如圖 1（b））和 CE（如圖 1（c））的影響差異極顯著，BE（如圖1（d））和 DE（如圖 1（e））的影響差異顯著。通過(guò)軟件分析得到最佳的處方及工藝為：NaDC（149.00 mg），Tx100（198.50 mg），Brij 58（249.00 mg），水化體積（5.58 mL），投藥量（14.95 mg）。在此條件下，重復(fù)試驗(yàn)3次，包封率和載藥量分別為98.63%和3.38%，d值為0.77，與預(yù)測(cè)值相差3.75%，說(shuō)明此方程與實(shí)際情況擬合較好。

表7 載藥復(fù)合納米膠束的響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table7 Experimental results of the response surface method of composite nano-micelles

（續(xù)表7）

表8 方差分析Table8 Variance analysis

（續(xù)表8）

3.3 妥曲珠利復(fù)合納米膠束的增溶效果

由表9可知，妥曲珠利復(fù)合納米膠束顯著增加了妥曲珠利的飽和溶解度。復(fù)合納米膠束主要是通過(guò)不同表面活性劑分子之間的范德華力、氫鍵和疏水作用等形成的非共價(jià)鍵，疏水端與疏水端相互聚集，水分子通過(guò)氫鍵與親水端結(jié)合，從而減少疏水端形成聚集體后的自由能，最終使得該膠束體系穩(wěn)定存在[10-11]。妥曲珠利分子被NaDC、Tx100、Brij58這3種表面活性劑包裹，表面活性劑分子與藥物之間的相互作用力導(dǎo)致膠束對(duì)藥物的增溶作用。

圖1 各因素相互作用響應(yīng)面圖Figure1 Interaction response surface of each factor

表9 復(fù)合膠束凍干制劑復(fù)溶后中妥曲珠利的增溶效果Table9 The effects of the solution after dissolution of the dissolution of lyophilized mixed micelles of toltrazuri

4 討論

NaDC是一種優(yōu)良的難溶性藥物的增溶劑和吸收促進(jìn)劑，常用于藥物劑型的設(shè)計(jì)中，如脂質(zhì)體[12]、脂質(zhì)囊泡[13]、微乳[14]以及膠束[6]等新劑型。我們的研究表明NaDC與Tx100具有較強(qiáng)的協(xié)同增溶作用，這種協(xié)同作用主要來(lái)源于NaDC甾醇結(jié)構(gòu)的α羥基與Tx100的質(zhì)子受體之間的強(qiáng)烈相互作用[15]。本實(shí)驗(yàn)中，NaDC與Tx100之間的協(xié)同作用強(qiáng)于Brij58-Tx100和Brij58-NaDC，這是因?yàn)镹aDC有一個(gè)疏水性的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這個(gè)結(jié)構(gòu)與Tx100的苯環(huán)之間存在較強(qiáng)的疏水作用力和范德華力，而B(niǎo)rij58為線性分子，與NaDC和Tx100之間的協(xié)同增溶能力主要來(lái)源于分子間的氫鍵。綜上所述，這3種表面活性劑之間結(jié)合導(dǎo)致的強(qiáng)烈的協(xié)同作用力主要來(lái)自非共價(jià)鍵的疏水作用力、范德華力和氫鍵。

本研究所制備的復(fù)合納米膠束制劑中的妥曲珠利分子被NaDC、Tx100、Brij58這3種表面活性劑包裹。表面活性劑單體分子通過(guò)非共價(jià)鍵的形式在溶液中自組裝形成膠團(tuán)狀的納米級(jí)聚集體，其表面和內(nèi)部的結(jié)構(gòu)緊密有序的形成星形、球形以及蠕蟲(chóng)形等[16]，表面活性劑單體分子不斷與膠束的表面活性劑之間進(jìn)行交換，膠束結(jié)構(gòu)在水溶液中存在是一個(gè)動(dòng)力學(xué)平衡過(guò)程，其主要的成分和比例具有一定的穩(wěn)定性[17-18]。復(fù)合納米膠束由于組成成分較多，膠束結(jié)構(gòu)緊湊，表面活性劑分子與藥物之間的相互作用力更強(qiáng)，導(dǎo)致膠束對(duì)藥物的增溶能力更強(qiáng)，因此其載藥量更高，進(jìn)而顯著增加藥物在水中的溶解度。