翁嘉華，石 真，胡延春，胡力文，符 杰，左之才，彭廣能，鄧俊良

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院/動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130）

紫莖澤蘭（Eupatorium adenophorum）作為被我國環(huán)?？偩执_定為最重要的16種外來入侵生物之一的植物[1]，自20世紀(jì)40年代入侵中國以來，其每年能造成巨大的生態(tài)災(zāi)難以及經(jīng)濟(jì)損失[2]，現(xiàn)在仍以每年60 km的速度向北和向東蔓延。然而研究表明紫莖澤蘭具有很好的殺螨作用[3-5]，對牛螨[6]、兔螨[7-8]以及動物疥螨都具有很明顯的控制作用。

螨蟲病作為一種表皮寄生蟲病，具有接觸傳染性，其一般先在嘴、鼻孔、眼周以及腳爪部發(fā)生病變，然后向四肢、頭腹部等其他部位擴(kuò)展[9]，使動物產(chǎn)生表皮瘙癢、抓撓、長痂皮等特征，感染嚴(yán)重者會導(dǎo)致營養(yǎng)不良，機(jī)體功能下降，更有甚者會出現(xiàn)死亡。目前常用的治療螨蟲的藥物有伊維菌素、雙甲脒、天然除蟲菊酯等。董艷芳等[10]利用伊維菌素治療兔螨蟲病，取得顯著的效果。近年研究表明長期使用此類藥物會造成動物中毒，產(chǎn)生耐藥性，并可能造成藥物殘留以及環(huán)境污染[11-12]。所以低毒高效無殘留的殺螨劑對于螨蟲的防治以及環(huán)境保護(hù)具有深刻的意義。本試驗將具有殺螨活性的紫莖澤蘭提取物制備成殺螨噴劑，并對其臨床殺螨效果進(jìn)行評價，為紫莖澤蘭的功能開發(fā)以及市場應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

本試驗所用紫莖澤蘭均于2016年7月采自四川省涼山州。采集生長健康茂盛的植株，放置于室內(nèi)或者沒有太陽的地方陰干，并在干燥環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：HC-280T2型中藥粉碎機(jī)（永康市綠可食品機(jī)械有限公司）、DZKW-4型電子恒溫水浴鍋（上海宜宣儀器紗篩廠）、1260型高效液相色譜儀（Agilent Technologies）、JJ-1型增力電動攪拌器（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）、R201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市英裕高科技儀器廠），CP2245型電子分析天平（Sariorius）。

主要試劑：乙醇（分析純，成都市科龍化工試劑廠）、聚山梨酯-80（分析純，四川西隴化工有限公司）、月桂氮酮（分析純，鄭州津北化工有限公司）、甲醇（分析純，天津市光復(fù)科技有限公司）、乙酸乙酯（分析純，成都市科龍化工試劑廠）。

1.3 紫莖澤蘭浸膏的制備

將風(fēng)干的紫莖澤蘭用中藥粉碎機(jī)粉碎為粉末，然后過40目篩去除大顆粒殘渣。加入甲醇浸泡過夜，重復(fù)浸泡3次，合并濾液，過濾，減壓蒸干。將得到的浸膏用萃取液（甲醇∶乙酸乙酯∶水=1∶5∶4）萃取，收集上層有機(jī)相，減壓蒸干。稱取一定量的浸膏，乙醇溶解，在40℃條件下加入粉末狀活性炭吸附脫色，過濾，再次減壓蒸干，-20℃條件下保存浸膏。

1.4 正交設(shè)計

紫莖澤蘭噴劑的制備過程主要是將紫莖澤蘭浸膏用一定比例的乳化劑、助溶劑以及透皮劑等溶解，并稀釋即可。經(jīng)過預(yù)試驗篩選，本試驗主要選擇的乳化劑為聚山梨酯-80，助溶劑為乙醇，透皮劑為月桂氮酮。本試驗主要考察以上3個因素，各取3個水平（見表1）進(jìn)行L9（34）正交試驗，并以9-羰基-10，11-去氫澤蘭酮的透皮釋放率作為考察指標(biāo)，篩選出最佳配方比例。

表1 因素水平表Table1 Factor level table

1.5 透皮釋放試驗

參考金偉等[13]的方法。將透析袋剪成小段，在2%碳酸氫鈉和1 mmol/L EDTA混合液（體積比1∶1，pH=8）中煮沸10 min，用蒸餾水徹底洗凈，并將其剪成單層，放入1 mmol/L的EDTA（pH=8）中煮沸10 min。冷卻后，存放于4℃冰箱中。將處理好的透析膜固定于改良的Franz擴(kuò)散池上，加入制備好的噴劑，接收池內(nèi)加入生理鹽水作為擴(kuò)散介質(zhì)。透皮試驗裝置設(shè)置為恒溫37℃[14]、轉(zhuǎn)速200 r/min，分別于2、4、8、12、24 h 取樣 3 mL，同時補足同等溫度的生理鹽水。將取出的接收液保存，并用HPLC法測定其中9-羰基-10，11-去氫澤蘭酮的濃度。根據(jù)公式Q=（VCn+∑ViCi)/A，24 h 內(nèi)累積透過率=（Q24×A/樣品總量）×100%。其中Q為第n次取樣時的累積透皮釋放量，V為接受池的體積（mL），Cn為第n次取樣點的濃度（μg/mL），Vi為第 i次取樣的體積（mL），Ci為第i次取樣點的濃度（μg/mL），A為擴(kuò)散釋放面積（cm2）。

1.6 紫莖澤蘭殺螨噴劑的臨床殺螨效果評價

30只疥螨感染情況相近的新西蘭白兔，體重（2.35±0.13）kg，公母各半，隨機(jī)分為 5組，即空白對照組Ⅰ（蒸餾水）、陽性對照組Ⅱ（伊維菌素）以及高中低劑量組（Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ：8 mg/mL、4 mg/mL、2 mg/mL），每組6只，分籠飼養(yǎng)，自由采食，飲水。陽性對照組每周肌肉注射1次，持續(xù)兩周；空白對照與試驗組每兩天對患病部位噴灑藥液1次，用藥兩周。每周對其臨床癥狀進(jìn)行評分，癥狀評分表見表2。同時每周對每只兔子進(jìn)行體重、呼吸、心率以及體溫等進(jìn)行測定。并對精神狀態(tài)，糞便進(jìn)行觀察，為期4周。

表2 癥狀評分表Table2 Symptom score

1.7 數(shù)據(jù)分析

將所得的數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)間采用單因素（One-Way ANOVA）分析，以P＜0.05作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，試驗所測得數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交設(shè)計結(jié)果

由表3、表4 可知，RA＞RC＞RB，即聚山梨酯-80的用量對透皮結(jié)果影響效果最大，乙醇的用量次之，最后是月桂氮酮的用量。由表4可知聚山梨酯-80對透皮結(jié)果的影響具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其他因素則無顯著影響，說明聚山梨酯-80是關(guān)鍵因素。綜合預(yù)試驗以及從節(jié)約成本考慮，最終確定最佳處方為 A2B2C1，即 3%的聚山梨酯-80（V/V)、2%的月桂氮酮（V/V）、20%的乙醇（V/V）。

表3 正交試驗結(jié)果Table3 The results of orthogonal test

表4 方差分析表Table4 ANOVA table

2.2 臨床效果評價

2.2.1 評分變化

由表5可知，試驗期間，Ⅰ組的癥狀基本沒有好轉(zhuǎn)，隨著時間的遷移，評分愈加嚴(yán)重，第28天對照組新西蘭白兔癥狀達(dá)到最嚴(yán)重的狀態(tài)。Ⅱ組在第7天開始，癥狀明顯減退，評分與Ⅰ組差異顯著（P＜0.05），自第14天起，癥狀幾乎消失，評分接近為0；Ⅲ～V 組在第 7天開始，癥狀顯著降低（P＜0.05），第21天各紫莖澤蘭噴劑組癥狀評分已幾乎為0。

2.2.2 體重變化

由表6可知，Ⅱ組新西蘭白兔體重隨時間的延長而逐漸增長，維持正常生長發(fā)育，整個試驗期間平均增重0.37 kg；Ⅰ組新西蘭白兔體重隨時間的延長而逐漸降低，并在第21天顯著低于Ⅱ組平均體重（P＜0.05），整個試驗期間呈負(fù)增重（-0.34±0.13）kg；Ⅲ組新西蘭白兔體重整體變化趨勢為先降低后增加，自第21天起，Ⅲ組新西蘭白兔體重出現(xiàn)緩慢增加的現(xiàn)象，整個試驗期間平均增重0.07 kg；Ⅳ組以及Ⅴ組新西蘭白兔體重整體變化趨勢為緩慢增加，與Ⅱ組相比無差異性（P＞0.05），最終平均增重分別為 0.38 kg和 0.32 kg。

表5 用藥后癥狀評分Table5 Symptom score after treatment

2.2.3 呼吸頻率變化

由表7可知，試驗期間，Ⅱ組新西蘭白兔呼吸頻率基本維持在正常范圍。與Ⅱ組相比，Ⅰ組新西蘭白兔呼吸頻率在第21天出現(xiàn)降低的趨勢（P＜0.1），在第28天，呼吸頻率顯著降低（P＜0.05）；與Ⅱ組相比，除了Ⅴ組在第21天呼吸頻率有增加的趨勢（P＜0.1）外，Ⅲ組、Ⅳ組以及Ⅴ組新西蘭白兔呼吸頻率均不存在顯著性差異，維持在正常范圍內(nèi)。

2.2.4 心率變化

由表8可知，與其他各組相比，Ⅰ組新西蘭白兔心率在第28天出現(xiàn)顯著升高（P＜0.05）。Ⅱ組與試驗組新西蘭白兔心率基本維持在正常范圍，無變化。

2.2.5 體溫變化

由表9可知，試驗期間，Ⅱ組與試驗組新西蘭白兔體溫?zé)o顯著性變化，均在正常范圍內(nèi)；Ⅰ組新西蘭白兔體溫在第21天出現(xiàn)升高趨勢（P＜0.1），并于第28天出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。

2.2.6 精神狀態(tài)以及糞便變化

試驗期間，所有新西蘭白兔的糞便皆為成型顆粒狀，無任何坨狀與糊狀等不規(guī)則狀態(tài)。試驗初期，所有患病新西蘭白兔除身上有瘙癢，不時抓撓自己外，精神狀態(tài)飽滿，無異常。第14天開始，Ⅰ組出現(xiàn)精神不振，食欲減退現(xiàn)象，身上瘙癢加劇，而Ⅱ組與試驗組瘙癢明顯減輕，且精神狀態(tài)依舊正常。從第21天開始起，Ⅰ組出現(xiàn)伏地不愿走動現(xiàn)象，而Ⅱ組與試驗組癥狀精神飽滿，瘙癢癥狀消失。

表6 用藥前后體重變化Table6 Weight changes after treatment kg

表7 用藥后呼吸頻率變化Table7 Changes of respiratory amplitude after treatmenttimes·min-1

表8 用藥后心率變化Table8 Changes of heart rate after treatment times·min-1

表9 用藥后體溫變化Table9 Temperature changes after treatment℃

3 討論

噴霧劑直接作用于患病部位，藥物吸收快，吸收率高，藥效迅速。較內(nèi)服給藥或者注射用藥更加有效且安全，可避免藥物對胃腸道的不良刺激，同時也能避免肝、胃、腸道對于藥物的代謝降解作用，對機(jī)體的傷害更小。對于皮膚性疾患，噴霧劑是首要的給藥方式。

透皮釋放試驗中選擇透析膜而非常見的離體鼠皮，主要是考慮到鼠皮制作中存在雜質(zhì)排除不干凈且制作不統(tǒng)一的因素，以及離體鼠皮長時間與接收液接觸后，其皮膚中的蛋白質(zhì)會出現(xiàn)脫落溶解等現(xiàn)象，這會導(dǎo)致接受液渾濁并干擾含量測定，而噴劑中主要活性成分含量較低，因此本試驗選擇規(guī)格統(tǒng)一的透析膜[15]。這與實驗結(jié)果中僅聚山梨酯-80的用量對透皮吸收結(jié)果影響顯著或許有關(guān)系。

在第14天之前，Ⅲ組的體重呈現(xiàn)下降趨勢，并自第14天開始與Ⅱ組呈現(xiàn)顯著差異，可能是Ⅲ組濃度偏高，在殺滅螨蟲的同時，過多的藥物殘留對動物產(chǎn)生了不利影響，阻止了新西蘭白兔體重的增加，這可能與第21天Ⅲ組依然表現(xiàn)出輕微癥狀有關(guān)。第21天開始，Ⅲ組體重呈現(xiàn)升高趨勢，說明Ⅲ組患病新西蘭白兔正逐漸恢復(fù)健康。然而尚不明確Ⅲ組高濃度紫莖澤蘭噴劑是否引起新西蘭白兔中毒，下一步有必要進(jìn)行紫莖澤蘭殺螨噴劑的毒性試驗研究。Ⅴ組的患病新西蘭白兔的呼吸頻率在第21天出現(xiàn)加快的趨勢，同時有體溫降低的趨勢，或許這與劑量偏低有關(guān)系。陳偉紅等[16]研究發(fā)現(xiàn)，山羊食用不同劑量的紫莖澤蘭，在精神狀態(tài)，糞便以及體重與體溫等方面會出現(xiàn)顯著變化，而本試驗中試驗組新西蘭白兔未出現(xiàn)以上報道現(xiàn)象，可能與給藥途徑、濃度與試驗時間不同有關(guān)。

研究表明疥螨病能夠造成家兔體重下降[17]，這與本試驗結(jié)果相符。Nong X.等[18]研究表明，0.5 g/mL的紫莖澤蘭乙醇提取物對兔疥螨與兔癢螨具有明顯的控制作用，本試驗中紫莖澤蘭殺螨噴劑的主要提取物濃度遠(yuǎn)低于此濃度，同樣達(dá)到了顯著的臨床殺螨效果，原因在于本試驗用藥頻次更高，同時加入透皮劑能夠更大效率提高活性物質(zhì)的利用率。郭于瑜等[19]研究發(fā)現(xiàn)家兔食用紫莖澤蘭，會導(dǎo)致慢性中毒，考慮到紫莖澤蘭的毒副作用，試驗建議臨床用藥濃度為4 mg/mL。He Y.J.等[20-21]研究表明紫莖澤蘭對山羊具有肝腎毒性，本試驗未涉及此內(nèi)容，所以下一步有必要對于紫莖澤蘭殺螨噴劑的肝腎毒性，以及臨床應(yīng)用的安全性作出系統(tǒng)評價。

紫莖澤蘭作為入侵植物，其在防治方面的研究進(jìn)展并不太順利，目前越來越多的轉(zhuǎn)向紫莖澤蘭的利用方向開始研究[22-25]。我國自古就有開發(fā)有毒植物藥用價值的傳統(tǒng)，如利用砒霜、蛇毒以及雷公藤等。紫莖澤蘭被視為有毒植物[26]，同樣研究證明其具有顯著的殺螨作用。本試驗依照此事實依據(jù)，將紫莖澤蘭提取物制備成了殺螨噴劑，為紫莖澤蘭的利用提供了新的思路。此方法僅在新西蘭白兔身上做出初步嘗試，效果顯著，但要應(yīng)用于寵物行業(yè)市場，還需要多次的臨床試驗。此方法為紫莖澤蘭殺螨噴劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供了試驗依據(jù)，同時可為植物源噴劑的研究提供一定的可行性參考。

4 結(jié)論

紫莖澤蘭殺螨噴劑最佳配方為：紫莖澤蘭甲醇提取物4 mg/mL、3%聚山梨酯-80、2%月桂氮酮、20%乙醇。該配方臨床殺螨效果顯著，可以作為紫莖澤蘭開發(fā)利用的重要途徑之一。