楊 園，聶林曼，付體華

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130）

普通小麥（Triticum aestivum L.）的改良依賴于豐富的遺傳多樣性，而小麥育種中所需的大多數(shù)有利遺傳變異都能夠由小麥族的野生近緣種作為基因源提供。遠(yuǎn)緣雜交是一種有效的植物物種間的基因轉(zhuǎn)移手段，在基因由小麥野生近緣種向普通小麥轉(zhuǎn)移的過(guò)程中尤為重要[1-2]。利用小麥與其野生近緣種的遠(yuǎn)緣雜交，育種者已合成了大量雙二倍體或部分雙二倍體。這些雙二倍體是重要基因轉(zhuǎn)移的中間載體，可以用于從小麥野生近緣物種向普通小麥中導(dǎo)入優(yōu)良性狀基因[3-4]。中間偃麥草（Thinopyrum intermedium，2n=6x=42，JJsSt）是一種多年生的異源六倍體草本植物，它具有許多優(yōu)良的遺傳多樣性，是小麥遺傳改良中一個(gè)重要的三級(jí)基因源[5-6]。過(guò)去的幾十年中，許多的屬間雜種和細(xì)胞遺傳系被創(chuàng)制并用于小麥育種中，這些品系包括不同小麥與偃麥草的部分雙二倍體、外源易位系、代換系以及附加系[4，7-12]?；蚪M原位雜交（GISH）技術(shù)具有簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確以及高效的特點(diǎn)，被廣泛地運(yùn)用于分析小麥與小麥野生近緣種的雜種后代的遺傳多樣性[13]?；跀M鵝觀草DNA（St染色體組）作為探針的GISH技術(shù)可將中間偃麥草染色體按雜交信號(hào)分布劃分為J，Js和St 3個(gè)染色體組[14]。中間偃麥草是一種自然雜交形成的多年生物種，據(jù)研究不同來(lái)源的中間偃麥草其染色體組成也不盡相同[15-17]?，F(xiàn)有的小麥-中間偃麥草部分雙二倍體并沒(méi)有包含中間偃麥草所有染色體[3]。因此，為了將中間偃麥草的優(yōu)良基因整合到小麥中，我們?nèi)孕枰粩鄤?chuàng)制和選育新的小麥-中間偃麥草部分雙二倍體。到目前為止，已經(jīng)有一些雙二倍體被培育出來(lái)，并在分子細(xì)胞遺傳學(xué)層次上對(duì)其染色體組結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，如TAF46、中字系列部分雙二倍體、Otrastsyuskaya（OT）、78829、TE-3、E990256、TE253和TAI8335等，這些雙二倍體所擁有的中間偃麥草染色體都存在一定的差異[3，6，18-21]，其中大多數(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于小麥改良中[5，22]。總的來(lái)說(shuō)，這些被報(bào)道的部分雙二倍體具有旺盛的生長(zhǎng)能力和高結(jié)實(shí)率，多數(shù)擁有56條染色體，通常由完整的小麥染色體組附加一個(gè)雜合的外源染色體組構(gòu)成[3]。也就是說(shuō)包含56條染色體的小麥-中間偃麥草部分雙二倍體其外源染色體數(shù)目都不少于14條。品系12-1179是我們實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)選育的一個(gè)小麥-中間偃麥草部分雙二倍體，不僅對(duì)當(dāng)前我國(guó)流行的條銹病和白粉病具有高度的抗性，而且其包含的外源染色體數(shù)目少于14條，這表明它是一個(gè)攜帶不同染色體結(jié)構(gòu)的新的部分雙二倍體。在本研究中，我們希望通過(guò)GISH和FISH技術(shù)確認(rèn)其染色體結(jié)構(gòu)和外源染色體來(lái)源，并對(duì)其潛在的白粉病和條銹病抗性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為其在遺傳育種研究的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料包括擬鵝觀草品系PI 232131（Pseudoroegneria spicata，St染色體組，2n=2x=24），小麥品種中國(guó)春、綿陽(yáng)26、品系SY95-71和小麥-中間偃麥草雙二倍體品系12-1179，其中品系12-1179由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院細(xì)胞遺傳實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)制、篩選和保存。該品系是以中國(guó)春小麥作為母本與中間偃麥草雜交得到F1代雜種，再與小麥栽培種綿陽(yáng)26回交得到F2代雜種，從F2代雜種自交篩選結(jié)實(shí)性好的植株繁殖到F8代。擬鵝觀草種子來(lái)源于美國(guó)國(guó)家小粒作物收集中心。品系SY95-71來(lái)源于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所的小麥，具有高度感染條銹病和白粉病能力[23]，作為感病對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞學(xué)鑒定

待種子在培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)到根尖約1.5～2 cm時(shí)，將根尖剪下放入一氧化二氮（N2O）中處理2 h，然后用90%的冰乙酸固定10 min，將其儲(chǔ)存于70%的乙醇中并于4℃冰箱中保存待用[24]。有絲分裂染色體制片根據(jù)Han F.等[25]的方法稍加改動(dòng)制備。減數(shù)分裂制片是采取處于減數(shù)分裂中期Ⅰ的麥穗并將其固定在卡洛固定液Ⅰ中，用品紅對(duì)花粉母細(xì)胞進(jìn)行染色。GISH采用擬鵝觀草DNA作為探針，而FISH采用Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1作為探針[26]。擬鵝觀草DNA采用地高辛（digoxigenin-11-dUTP）標(biāo)記，具體步驟按照地高辛說(shuō)明書操作，中國(guó)春小麥DNA作為封阻。GISH的操作步驟根據(jù)Chen Q.等[14]和Han F.等[27]的描述進(jìn)行。寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1的5'端分別用6-carboxyfluorescein（6-FAM）和6-carboxytetramethylrhodamine（Tamra）進(jìn)行標(biāo)記[26]，由上海 Invitrogen Biotechnology公司合成。合成的寡核苷酸探針用1×TE緩沖液溶解和稀釋，稀釋倍數(shù)按照Tang Z.X.等[26]的描述進(jìn)行，F(xiàn)ISH程序按照Han F.等[25]的描述進(jìn)行。利用帶有CMOS相機(jī)以及Spotsoftware（V.4.6）的熒光顯微鏡（Nikon Eclips80i）進(jìn)行照相。

1.2.2 抗病性鑒定

品系12-1179以及其親本的白粉病與條銹病抗性測(cè)試分別在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行。小麥品系SY95-71屬于高感條銹病與白粉病的感染型（infection types，ITs），在本實(shí)驗(yàn)中被用作陽(yáng)性對(duì)照評(píng)價(jià)小麥感病程度。通過(guò)在苗期接種3個(gè)白粉病菌株（E20，E21和race 15）來(lái)評(píng)價(jià)測(cè)試小麥品系的白粉病抗性，而在成株上接種當(dāng)前流行的混合的條銹病菌（包括條中 30，31，32及水源-46）評(píng)價(jià)測(cè)試小麥品系的條銹病抗性，條銹病菌由四川農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。當(dāng)SY95-71高度感病時(shí)，按照0到4級(jí)評(píng)價(jià)體系記載所鑒定品系的白粉病和條銹病抗性[28-29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 品系12-1179的形態(tài)學(xué)以及農(nóng)藝性狀調(diào)查

成株12-1179表現(xiàn)為小麥-中間偃麥草中間形態(tài)，但更加偏向于其小麥親本（圖1a）。它具有直立生長(zhǎng)的習(xí)性，成株高度在95～105 cm，矮于中國(guó)春小麥（125 cm）而高于綿陽(yáng)26小麥（88 cm）。在田間，每個(gè)植株平均能產(chǎn)生4～6個(gè)有效分蘗；穗長(zhǎng)為14～17 cm，每個(gè)麥穗具有17～20個(gè)小穗數(shù)，小穗在穗軸上分布較稀疏（圖 1b），平均結(jié)實(shí)率70%左右。種子的形態(tài)像中間偃麥草，種子細(xì)長(zhǎng)但比較飽滿（圖1c），千粒重為28 g左右，界于小麥與中間偃麥草之間的水平。

圖1 小麥栽培種綿陽(yáng)26與品系12-1179的形態(tài)特征Figure1 The morphology features of wheat cultivar Mianyang 26 and amphiploid line 12-1179

2.2 品系12-1179的細(xì)胞學(xué)鑒定

對(duì)28株12-1179材料進(jìn)行了根尖染色體計(jì)數(shù)。不同植株的染色體數(shù)目為54～57條，78.57%的植株染色體數(shù)目為56條（表1）。在部分非整倍體（2n=54或55）中可觀察到1～2個(gè)端著絲粒染色體（表1）。對(duì)12-1179植株（2n=56）減數(shù)分裂中期Ⅰ染色體的配對(duì)行為進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)有54.05%的花粉母細(xì)胞（PMCs）能形成28個(gè)二價(jià)體（圖 2a），而在其他花粉母細(xì)胞中單價(jià)體為0～8個(gè)。少量的花粉母細(xì)胞中偶爾會(huì)觀察到一個(gè)三價(jià)體或四價(jià)體（圖2b）。通過(guò)對(duì)175個(gè)花粉母細(xì)胞（2n=56）減數(shù)分裂的統(tǒng)計(jì)，其減數(shù)分裂配對(duì)構(gòu)型為1.33Ⅰ+27.26Ⅱ+0.01Ⅲ+0.03Ⅳ（表2），表明品系12-1179在減數(shù)分裂傳代過(guò)程中基本保持穩(wěn)定。

使用擬鵝觀草DNA為探針，中國(guó)春小麥DNA為封阻的GISH技術(shù)對(duì)品系12-1179的外源染色體進(jìn)行了鑒定，28株12-1179材料的外源染色體組成結(jié)構(gòu)列于表1。結(jié)果表明所有12-1179植株的根尖細(xì)胞都僅含有12條中間偃麥草染色體（圖3a），未發(fā)現(xiàn)小麥-中間偃麥草易位染色體。根據(jù)GISH信號(hào)分布特點(diǎn)[14]，可將這12條外源染色體區(qū)分成中間偃麥草不同的染色體組。其中，6條染色體上都有強(qiáng)烈的雜交信號(hào)，屬于St染色體組，4條染色體著絲粒和端粒有強(qiáng)烈的雜交信號(hào)，屬于Js染色體組，而余下2條染色體一條臂在端粒處有雜交信號(hào)，而另一條整臂和著絲粒處都有雜交信號(hào)，屬于St-Js易位染色體（圖3a），易位染色體的易位點(diǎn)需進(jìn)一步研究確定。在12-1179中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)J染色體。對(duì)減數(shù)分裂染色體的GISH分析表明減數(shù)分裂中期Ⅰ的花粉母細(xì)胞有6個(gè)二價(jià)體具有雜交信號(hào)（圖3b）。說(shuō)明品系12-1179的12條外源染色體能夠在減數(shù)分裂期間正常配對(duì)，表明12-1179的外源染色體由3對(duì)St，2對(duì)Js以及1對(duì)St-Js易位染色體構(gòu)成。

表1 28個(gè)12-1179植株的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)Table1 Chromosome number and constitution in 28 plants of line 12-1179

表2 5個(gè)12-1179（2n=56）植株減數(shù)分裂中期I的配對(duì)統(tǒng)計(jì)Table2 Chromosome pairing at metaphase I in five 56-chromosome plants of line 12-1179

圖2 品系12-1179的減數(shù)分裂中期Ⅰ的結(jié)構(gòu)Figure2 Meiotic configurations at metaphaseⅠof line 12-1179

使用寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1和OligopTa535-1對(duì)品系12-1179進(jìn)行FISH分析以觀察小麥染色體數(shù)目及組成。結(jié)果表明12-1179具有完整的A和B染色體組，而在不同12-1179植株中有不同數(shù)目的D染色體。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，在12-1179植株（2n=54-57）中，5D 染色體數(shù)目為 2～5條（圖 3c～圖3e），而在2n=56的12-1179植株中，5D染色體數(shù)目為4條（圖 3c）。此外，在非整倍體（2n=54-55）植株中觀察到的端著絲粒染色體都為5DL（表1和圖3e）。因此12-1179中缺失的一對(duì)中間偃麥草染色體應(yīng)屬于第五同源群，其功能在很大程度上由增加的2條5D染色體補(bǔ)償。所以品系12-1179的外源染色體組的組成是6St+4Js+2Js-St+2*5D。根據(jù)已有報(bào)道，小麥-中間偃麥草部分雙二倍體的外源染色體組一般只由中間偃麥草的3個(gè)染色體組構(gòu)成[3]，因此，品系12-1179屬于一個(gè)新的小麥-中間偃麥草部分雙二倍體。

2.3 抗病性鑒定結(jié)果

利用當(dāng)前流行的白粉病菌株和混合的條銹病菌對(duì)品系12-1179及其親本進(jìn)行了抗病性鑒定。從田間表現(xiàn)來(lái)看，中間偃麥草與12-1179對(duì)所有接種的白粉病與條銹病都免疫，而小麥栽培種中國(guó)春和綿陽(yáng)26都表現(xiàn)高感（表3）。由于品系12-1179的小麥親本都高感白粉病與條銹病，因此，12-1179的白粉病和條銹病抗性很可能來(lái)源于它的供體親本-中間偃麥草。

圖3 品系12-1179植株的GISH和FISH分析Figure3 GISH and FISH patterns of line 12-1179

3 討論與結(jié)論

對(duì)合成的小麥-外緣物種雙二倍體進(jìn)行細(xì)胞學(xué)的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)在育種過(guò)程中具有理論指導(dǎo)和實(shí)際意義。一般而言合成的小麥-中間偃麥草雙二倍體都具有較穩(wěn)定的減數(shù)分裂行為，其二價(jià)體頻率高而多價(jià)體頻率低，同時(shí)具有良好的結(jié)實(shí)率[18]。G.Fedak等[3]報(bào)道不同的小麥-中間偃麥草部分雙二倍體減數(shù)分裂中期I的二價(jià)體頻率變化在25.12～27.46之間，而單價(jià)體頻率在0.43～2.55之間。在我們所研究的2n=56植株中，由于存在4條5D染色體，理論上每一個(gè)減數(shù)分裂細(xì)胞中至少應(yīng)發(fā)現(xiàn)一個(gè)四價(jià)體，然而根據(jù)175個(gè)花粉母細(xì)胞（2n=56）統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)54.05%的細(xì)胞能形成28個(gè)二價(jià)體，平均每個(gè)細(xì)胞有1.33個(gè)單價(jià)體，而每個(gè)細(xì)胞平均出現(xiàn)0.01個(gè)三價(jià)體和0.03個(gè)四價(jià)體，其多價(jià)體的數(shù)量遠(yuǎn)小于預(yù)期（表2）。表明品系12-1179減數(shù)分裂中期Ⅰ的染色體配對(duì)行為與已報(bào)道穩(wěn)定的部分雙二倍體相似[6，13，18]，也類似于穩(wěn)定的普通小麥缺體-四體的配對(duì)行為[30]。這表明品系12-1179在細(xì)胞學(xué)上十分穩(wěn)定，因此具有比較高的結(jié)實(shí)率，這些結(jié)果說(shuō)明品系12-1179的染色體遺傳組成在很大程度上是平衡的[3]。

表3 12-1179和其親本的條銹病與白粉病的抗性鑒定Table3 Reactions to stripe rust and powdery mildew in partial amphiploid12-1179 and its parents

了解部分雙二倍體的外源染色體對(duì)于高效地將其優(yōu)良性狀轉(zhuǎn)移到小麥中進(jìn)行改良是非常重要的。因此，不同學(xué)者采用不同手段對(duì)選育的小麥-中間偃麥草部分雙二倍體染色體組成進(jìn)行鑒定。根據(jù)報(bào)道，所有小麥-中間偃麥草雙二倍體（2n=56）的外源染色體都不少于14條，其中至少包括St，J和Js中的兩種，且小麥染色體至多42條[3，21]。在本研究中，通過(guò)GISH分析表明品系12-1179的外源染色體只有12條，其中包括3對(duì)St，2對(duì)Js和1對(duì)Js-St易位染色體。品系12-1179的外源染色體少于已有報(bào)道雙二倍體（2n=56）的外源染色體數(shù)目（圖 3a）。FISH分析表明，12-1179包含4條5D染色體（圖 3c），但能進(jìn)行穩(wěn)定地減數(shù)分裂且結(jié)實(shí)率達(dá)70%。由此我們推測(cè)中間偃麥草染色體組中的一對(duì)外源染色體由兩條5D替換，而且外源染色體缺失的功能由5D染色體補(bǔ)償，因此這個(gè)復(fù)合的外源染色體組不僅包含中間偃麥草染色體，還應(yīng)該包含兩條5D染色體。12-1179具有不同于已報(bào)道的部分雙二倍體，如中字系列[19]，TAF46[31]，78829[32]，OT[18]，TAI8335[6]和 TE253[13]等的染色體組成，以上部分雙二倍體都擁有一個(gè)由14條不同中間偃麥草染色體組成的復(fù)合染色體組，因此12-1179是一個(gè)新的小麥-中間偃麥草部分雙二倍體。

在農(nóng)藝性狀方面，成株12-1179與小麥親本更相似，卻沒(méi)有旺盛的生長(zhǎng)習(xí)性和分蘗能力，小穗數(shù)也偏少，可能原因是第五同源群的中間偃麥草染色體被小麥5D替換所致。我們知道調(diào)節(jié)小麥春化作用以及區(qū)分小麥為春性、冬性和半冬性基因Vrn位于小麥第5同源群染色體長(zhǎng)臂上，特別是5AL和5DL[33-35]。Vrn基因負(fù)責(zé)調(diào)控小麥營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)之間的轉(zhuǎn)換[36]。中國(guó)春小麥5D缺體是唯一導(dǎo)致小麥產(chǎn)生冬小麥習(xí)性且使抽穗期延遲的缺體小麥[37]，所以小麥染色體5D替換了中間偃麥草的第五同源群染色體，導(dǎo)致品系12-1179的冬性特征減弱而更類似于春小麥親本且分蘗能力較弱。

中間偃麥草作為一種重要的多年生小麥族物種，對(duì)多種真菌病害有良好的抗性以及對(duì)不利環(huán)境有很好的耐受性[16，19，38]。因此，中間偃麥草在小麥遺傳改良中能作為抗性基因的供體被廣泛地使用。迄今為止，抗小麥條紋花葉病毒（WSMV）[39]、抗大麥黃矮病毒（BYDV）[32，40-41]、抗鐮刀菌枯萎病[42]、抗條銹病[9]、抗葉銹病[43]、抗莖銹病[22]和抗白粉病基因[11，44-45]已經(jīng)被鑒定并從中間偃麥草轉(zhuǎn)移到小麥中應(yīng)用。

白粉病和條銹病是兩種世界最嚴(yán)重的小麥疾病，每年在全世界引起小麥大規(guī)模減產(chǎn)。已有報(bào)道中，中間偃麥草Js或St染色體上的白粉病和條銹病抗性基因已經(jīng)轉(zhuǎn)移運(yùn)用到小麥中。B.Friebe等[43]報(bào)道了一個(gè)被定位在7Ai-2染色體上的條銹病抗性基因，Tang S.等[16]鑒定7Ai-2染色體屬于Js染色體組。而來(lái)源于小麥-中間偃麥草后代品系X479的條銹病抗性基因則被定位在1St染色體上[12]。He R.L.等[44]研究發(fā)現(xiàn)白粉病抗性基因Pm43是從一條未知的Js染色體上轉(zhuǎn)移到小麥的2DL上。通過(guò)C帶和GISH鑒定，同樣來(lái)源于普通小麥與中間偃麥草抗白粉病品系08-723，發(fā)現(xiàn)其攜帶的白粉病抗性基因來(lái)源于一條6AS與St的易位染色體[11]。在本研究中，品系12-1179包含6條St，4條Js和2條St-Js，對(duì)條銹病和白粉病具有免疫的特性，其白粉病和條銹病抗性基因應(yīng)來(lái)源于St或Js。但其抗性基因是否與以往報(bào)道相同，還需要進(jìn)一步研究。現(xiàn)在我們正在通過(guò)抗性篩選來(lái)選育具有抗白粉病與條銹病的外源附加系，代換系以及易位系小麥。