袁 寧，管桂坤，萬自然，夏培禹，劉 宇，王 濤，陳葉福，鄭 楠，韓奇穎

（1.山東蘭陵美酒股份有限公司，山東臨沂277731；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；3.臨沂市環(huán)保局，山東臨沂276000）

“中國黃酒，天下一絕”，黃酒作為中華民族歷史最悠久、最古老的特色酒精飲料，以稻米、黍米等谷物為主要原料，利用麥曲、紅曲等所含的多種微生物以及酵母共同發(fā)酵釀制而成[1-2]。黃酒酒性柔和，酒味醇厚，已被越來越多的消費(fèi)者所青睞，同時(shí)黃酒含有氨基酸、維生素、微量元素等豐富的營養(yǎng)成分，不僅蛋白質(zhì)種類豐富，且含量為酒中之最[3]，同時(shí)含有酚類物質(zhì)、功能性低聚糖等功能因子，對(duì)人體具有保健作用[4]。

高級(jí)醇是指3個(gè)以上碳原子醇類的總稱，適量的高級(jí)醇不僅是酒類的主要呈香物質(zhì)之一，還能豐富酒的口味，增加其協(xié)調(diào)性。含量過高則會(huì)帶來令人不愉快的異雜味，另外，高級(jí)醇在體內(nèi)的氧化速度比乙醇慢，會(huì)較長時(shí)間停留在體內(nèi)，消費(fèi)者飲用后易醉、“上頭”，同時(shí)會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的危害，引起腦損傷以及認(rèn)知障礙，使人體神經(jīng)系統(tǒng)充血、頭疼，刺激眼、鼻以及黏膜等[5-6]。目前高級(jí)醇的主要來源分為降解代謝途徑與合成代謝途徑，而生產(chǎn)過程中高級(jí)醇含量控制主要從釀造黃酒原輔料、釀造工藝以及發(fā)酵工藝中的發(fā)酵溫度與釀酒酵母等途徑解決[7]。本試驗(yàn)通過改造釀酒酵母的添加，初步探索其在黃酒黍米中溫大曲和紅曲發(fā)酵中對(duì)高級(jí)醇含量的影響。

表1 兩種酵母玉米糖液培養(yǎng)期間的總酸和乙酸含量

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

原料及耗材：改造酵母，天津科技大學(xué)選育試驗(yàn)用菌株，交由山東蘭陵美酒股份有限公司試驗(yàn)用；常規(guī)黃酒酵母，安琪酵母股份有限公司；黍米，朝陽益充雜糧有限公司；中溫大曲，山東蘭陵美酒股份有限公司；紅曲，武漢佳成生物制品有限公司。

儀器設(shè)備：YXQ-LS-75SN立式壓力蒸汽滅菌鍋；JHT-系列凈化工作臺(tái)；MJX-280S智能霉菌培養(yǎng)箱；FLY-211C恒溫震蕩培養(yǎng)箱；安捷倫7890A氣相色譜儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母培養(yǎng)

糖度為10°Bx的滅菌玉米水解液接入常規(guī)黃酒酵母與改造酵母，放入恒溫?fù)u床30℃振蕩培養(yǎng)24 h后，測其菌數(shù)。

1.2.2 試驗(yàn)操作

將浸泡20 h以上的黍米蒸熟，黍米與水以1∶2的比例加入錐形瓶中，待冷至常溫，中溫大曲和紅曲的添加量均為15%，酵母添加量為2.4×108cfu/g，混勻，放入恒溫培養(yǎng)箱30℃發(fā)酵，6 d后測其高級(jí)醇、酒精度、總酸含量等指標(biāo)。

1.2.3 檢測方法

高級(jí)醇采用安捷倫7890A氣相色譜儀檢測、酒精度、總酸等指標(biāo)均采用常規(guī)方法測定[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米糖液培養(yǎng)兩種酵母產(chǎn)生的總酸及乙酸含量（表1）

黃酒醪液酸敗不但會(huì)降低原料的出酒率，還會(huì)對(duì)黃酒風(fēng)味及品質(zhì)產(chǎn)生嚴(yán)重影響，甚至導(dǎo)致整個(gè)發(fā)酵過程失敗，對(duì)機(jī)械化大罐生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失[9]。而原料種類、糖化曲質(zhì)量與用量以及釀酒酵母本身產(chǎn)酸等均會(huì)對(duì)黃酒醪液酸敗產(chǎn)生影響[10]，而由表1可以看出，與常規(guī)黃酒酵母相比，相同菌數(shù)的改造酵母經(jīng)過1 d與6 d培養(yǎng)后，總酸含量均相同，說明改造酵母本身沒有產(chǎn)生過多的總酸，對(duì)黃酒醪液酸敗影響不大。經(jīng)過1 d培養(yǎng)后，兩種酵母的菌數(shù)相差不大，但經(jīng)過6 d后，兩種酵母菌數(shù)差異明顯，而改造酵母培養(yǎng)1 d和6 d的菌數(shù)差異卻不大，推測改造酵母的生長活力要弱于常規(guī)黃酒酵母，可能改造酵母進(jìn)入衰亡期后對(duì)環(huán)境的抗逆性較差而導(dǎo)致生長受抑制，菌數(shù)減少。而改造酵母乙酸的產(chǎn)生量卻顯著超過常規(guī)黃酒酵母，說明改造酵母本身產(chǎn)乙酸的能力較強(qiáng)。

2.2 兩種酵母在黃酒中溫大曲和紅曲發(fā)酵6 d后的總酸和乙酸含量（表2）

表2總酸和乙酸含量

由表2可以看出，改造酵母在黃酒中溫大曲及紅曲發(fā)酵期間，總酸含量要稍高于常規(guī)黃酒酵母，但當(dāng)改造酵母的添加量增加一倍，其總酸含量等于或稍小于常規(guī)黃酒酵母，推測改造酵母生長活力較弱，對(duì)中溫大曲中的微生物抑制性較差，導(dǎo)致產(chǎn)酸菌生長，酸度增高，菌數(shù)加倍后酵母生長活力增強(qiáng)，對(duì)產(chǎn)酸菌的抑制性增強(qiáng)，酸度降低。由于改造酵母本身會(huì)產(chǎn)生較多乙酸，所以在黃酒發(fā)酵中改造酵母的乙酸含量與常規(guī)黃酒酵母相比，顯著增高，即使改造酵母添加量加倍，乙酸產(chǎn)量仍顯著高于常規(guī)黃酒酵母，但稍低于改造酵母的正常添加量組。

表3 兩種酵母中溫大曲和紅曲中發(fā)酵6 d后的高級(jí)醇含量 (mg/L)

2.3 兩種酵母在中溫大曲和紅曲發(fā)酵6 d后的高級(jí)醇含量及酒精度（表3、表4）

表4 兩種酵母中溫大曲和紅曲中發(fā)酵6 d后的酒精度 (%vol)

由表3可知，與常規(guī)黃酒酵母添加量相同以及添加量加倍的改造酵母在黃酒中溫大曲及紅曲中發(fā)酵的高級(jí)醇總量均不超過常規(guī)黃酒酵母的1/2，說明改造酵母降低高級(jí)醇含量顯著，在黃酒生產(chǎn)中具有很好的應(yīng)用前景。而表4顯示，與常規(guī)黃酒酵母添加量相同的改造酵母發(fā)酵6 d后，其酒精度低于常規(guī)黃酒酵母，添加量加倍后，其酒精度與常規(guī)黃酒酵母接近，進(jìn)一步說明改造酵母的活力較弱導(dǎo)致其發(fā)酵力較弱，酒精度降低。

2.4 兩種酵母在中溫大曲和紅曲中發(fā)酵6 d后相關(guān)酯的含量（表5）

表5 兩種酵母在中溫大曲及紅曲中發(fā)酵6 d后相關(guān)酯的含量 (mg/L)

由表5可以看出，改造酵母在中溫大曲與紅曲中經(jīng)過6 d發(fā)酵后的乳酸乙酯含量明顯低于常規(guī)黃酒酵母，而且隨著改造酵母添加量的增加，乳酸乙酯的含量逐漸降低，這說明改造酵母添加量的增大，可有效抑制乳酸菌等產(chǎn)乳酸雜菌的生長，導(dǎo)致乳酸乙酯前體物質(zhì)乳酸生成量下降。而中溫大曲發(fā)酵中，改造酵母的添加使得乙酸乙酯的含量顯著高于常規(guī)黃酒酵母，且隨著添加量的增加乙酸乙酯含量逐漸上升，2倍添加量產(chǎn)生的乙酸乙酯含量接近常規(guī)黃酒酵母的8倍，說明改造酵母在黃酒中溫大曲發(fā)酵中產(chǎn)生的乙酸乙酯為酯香的主體成分。但改造酵母在紅曲中發(fā)酵的乙酸乙酯含量沒有增加，2倍添加量產(chǎn)生的乙酸乙酯與常規(guī)黃酒酵母接近，與常規(guī)黃酒酵母相同添加量的改造酵母經(jīng)過6 d發(fā)酵后，其乙酸乙酯的含量卻低于常規(guī)黃酒酵母，由于中溫大曲的微生物體系比紅曲復(fù)雜，可能是中溫大曲中存在紅曲中沒有的相關(guān)微生物或酶可以改造酵母產(chǎn)生過多的乙酸轉(zhuǎn)化成乙酸乙酯，從而導(dǎo)致改造酵母在中溫大曲發(fā)酵期間產(chǎn)生的乙酸乙酯含量顯著增加。

3 總結(jié)

利用釀酒酵母的篩選或改造是降低黃酒高級(jí)醇含量的有效措施，楊魯君等[11]篩選出來的菌株F-18應(yīng)用于黃酒生產(chǎn)發(fā)酵，實(shí)驗(yàn)表明，其高級(jí)醇含量低于對(duì)照組菌株。王鵬銀等[12]誘變出的亮氨酸缺陷型菌株A713，高級(jí)醇總量可降低到33.62%，以及YOSHIMOTO H等[13]構(gòu)建的PDC1缺失突變菌株可使異戊醇的濃度下降31%。

試驗(yàn)所用改造酵母在黃酒釀造中降低高級(jí)醇含量非常顯著，不論中溫大曲還是紅曲發(fā)酵，與常規(guī)黃酒酵母相比，均可將高級(jí)醇總量降低多達(dá)50%，同時(shí)添加量加倍時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)生的酒精度與常規(guī)黃酒酵母相近。雖然改造酵母本身產(chǎn)生較高的乙酸，及在黃酒中溫大曲和紅曲發(fā)酵中的菌數(shù)與常規(guī)酵母相同的添加量所產(chǎn)生的總酸含量稍有增加，但添加量加倍時(shí)，總酸含量與常規(guī)黃酒酵母相同甚至略低，從而可避免黃酒醪液酸敗的發(fā)生。改造酵母在中溫大曲與紅曲發(fā)酵中的乳酸乙酯含量明顯降低，而且隨著改造酵母添加量的增加，乳酸乙酯的含量逐漸下降。而中溫大曲發(fā)酵中，改造酵母的添加使乙酸乙酯的含量顯著高于常規(guī)黃酒酵母，且隨著添加量的增加，乙酸乙酯含量逐漸上升，添加量加倍產(chǎn)生的乙酸乙酯含量接近常規(guī)黃酒酵母的8倍。因此，改造酵母降低高級(jí)醇的顯著特性在黃酒釀造及新酒品開發(fā)中具有很好的應(yīng)用前景。