葛馳宇 ，張君麗 ，周 敏

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇淮安223003；2.江蘇省蛋白質(zhì)類藥物工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇淮安223003；3.江蘇今世緣釀酒學(xué)院，江蘇淮安223005）

中國是酒文化大國，日趨高漲的酒類消費(fèi)市場讓中國成為酒精消費(fèi)第一大國的同時(shí)，也給國人的健康帶來了安全隱患。市場上各種各樣的“解酒藥”，大多數(shù)屬于西藥與中藥。西藥多是興奮劑，濫用會(huì)對(duì)身體產(chǎn)生一定的毒副作用[1-2]；而中藥解酒作用研究主要集中在葛花、甘草等藥材上[3-4]。因此，開發(fā)無毒、無副作用的新型解酒中藥材逐漸成為解酒制品研究的重要方向。大量研究表明[5-8]，化橘紅能較快地解酒并緩解醉酒過程中產(chǎn)生的不適；綠豆多肽可以加速機(jī)體對(duì)乙醇的代謝，起到較好的解酒作用[9]，且綠豆多肽屬于生物活性多肽，綠色健康、易吸收、來源廣、安全性較好[10]。但是目前對(duì)以綠豆多肽與化橘紅為主要原料的復(fù)合解酒產(chǎn)品的開發(fā)仍是空白。

本研究探討了綠豆多肽化橘紅復(fù)合解酒飲料（以下簡稱“綠橘解酒飲”）的解酒效果，并初步研究了其作用機(jī)制，以期為解酒制品的開發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

綠豆多肽純品（含量≥99%，m/m），化橘紅黃酮提取物（柚皮苷含量≥50%，m/m），磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS），實(shí)驗(yàn)室自制。RU21解酒藥，10 mg/mL，購自Spirit Science USA，INC；今世緣黃紀(jì)元酒，江蘇今世緣酒業(yè)股份有限公司，酒精度42%vol；乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）測定試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）測定試劑盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒，南京良瑋生物科技有限公司。

清潔級(jí)ICR小鼠，雄性，體重18～22 g，購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，合格證號(hào)SCXK（蘇）2007-0018。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；組織搗碎勻漿機(jī)，無錫沃信儀器制造有限公司；實(shí)驗(yàn)型飲料生產(chǎn)線，上海達(dá)程實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 綠橘解酒飲的制備

分別取若干綠豆多肽純品和化橘紅黃酮提取物置于實(shí)驗(yàn)型飲料生產(chǎn)線，混合攪拌均勻后高溫滅菌，灌裝，分別制得低、中、高3個(gè)劑量的綠橘解酒飲各20 mL。各劑量綠橘解酒飲含量見表1。

1.3.2 小鼠耐酒精性實(shí)驗(yàn)

表1 綠橘解酒飲高、中、低劑量含量

取ICR小鼠40只，體重18～22 g，隨機(jī)分成5組。禁食12 h后各組分別使用今世緣黃紀(jì)元酒按0.15mL/10g、0.20mL/10g、0.25mL/10g、0.30mL/10g和0.35 mL/10 g的比例進(jìn)行灌胃，觀察小鼠醉酒率及存活率等指標(biāo)，確定小鼠最適耐酒精灌胃劑量。其中，以小鼠翻正反射消失，閉眼沉睡為醉酒指標(biāo)，即灌胃今世緣黃紀(jì)元酒后，將小鼠背向下輕輕放在鼠籠里，如果小鼠保持仰位姿勢30 s以上，則認(rèn)為小鼠翻正反射消失，開始入睡，表明小鼠醉酒。

1.3.3 小鼠防醉與解酒實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 小鼠防醉實(shí)驗(yàn)

取ICR小鼠40只，按體重隨機(jī)分為5組，即陽性對(duì)照組、模型組、綠橘解酒飲低劑量組、綠橘解酒飲中劑量組與綠橘解酒飲高劑量組，每組8只。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h后，陽性對(duì)照采取公認(rèn)解酒效果較好的進(jìn)口藥物RU21，按人體推薦用量折算成小鼠灌胃劑量為0.2 mL/10 g，模型組灌胃0.2 mL/10 g PBS，高、中和低綠橘解酒飲組分別灌胃高、中、低劑量綠橘解酒飲0.2 mL/10 g。灌胃結(jié)束后，各組均在20 min后以0.25 mL/10 g劑量灌胃今世緣黃紀(jì)元酒，分別計(jì)時(shí)，記錄各組小鼠的睡眠潛伏時(shí)間（灌酒后到翻正反射消失、開始入睡的時(shí)間）和睡眠時(shí)間（入睡開始直至翻正反射恢復(fù)，蘇醒的時(shí)間）。

1.3.3.2 小鼠解酒實(shí)驗(yàn)

取ICR小鼠40只，分組同“1.3.3.1”項(xiàng)，各組分別灌胃今世緣黃紀(jì)元酒0.25 mL/10 g，各組小鼠灌酒后，高、中和低綠橘解酒飲組分別灌胃高、中、低劑量綠橘解酒飲0.2 mL/10 g，陽性對(duì)照組灌胃0.2 mL/10 g的RU21，模型組灌胃0.2 mL/10 g的PBS，記錄各組小鼠的睡眠時(shí)間。

1.3.4 綠橘解酒飲對(duì)醉酒小鼠血液中乙醇濃度的影響

1.3.4.1 醉酒小鼠血液的制備

取ICR小鼠48只，隨機(jī)分為6組，每組8只。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水，陽性對(duì)照組灌胃0.2 mL/10 g的RU21，空白對(duì)照組和模型組灌胃0.2 mL/10 g的PBS，綠橘解酒飲高、中、低組分別灌胃高、中、低劑量綠橘解酒飲0.2 mL/10 g，1天1次，連續(xù)7 d，末次給藥20 min后，模型組、綠橘解酒飲各組與陽性對(duì)照組小鼠分別灌胃0.25 mL/10 g劑量的今世緣黃紀(jì)元酒，空白對(duì)照組灌胃0.25 mL/10 g的PBS。經(jīng)測定，乙醇在小鼠血液中的達(dá)峰時(shí)間（Tmax）約為1 h，此時(shí)對(duì)所有小鼠摘眼球取血，將血置于含有肝素鈉的離心管中，混勻后于4℃，3000 r/min離心10 min，取血清。

1.3.4.2 色譜質(zhì)譜條件

本文擬采用自動(dòng)頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定小鼠血液中乙醇含量，使用內(nèi)標(biāo)法測定，內(nèi)標(biāo)為叔丁醇，方法借鑒參考文獻(xiàn)[11]，主要參數(shù)如下。

色譜條件：色譜柱：HP-5柱（30 m×0.320 mm，0.25 μm，安捷倫；5%苯基-95%甲基聚硅氧烷交聯(lián)柱，30 m×0.25 mm，0.25 μm，安捷倫）。載氣：N2，純度大于99.99%；載氣流量為1 mL/min，進(jìn)樣口溫度145℃，檢測器溫度220℃，柱溫50℃，分流比50∶1。

質(zhì)譜條件：離子源溫度250℃，電離方式為電子轟擊，電離能70 eV，傳輸線溫度250℃，溶劑切除時(shí)間1.2 min，掃描模式為選擇離子監(jiān)測模式，掃描間隔為0.1 s，掃描質(zhì)量范圍為29～150 amu。

自動(dòng)頂空條件：爐溫60℃，平衡時(shí)間20 min，振搖速度中速,傳輸線溫度100℃，進(jìn)樣傳輸線溫度90℃，進(jìn)樣間隔3 min，樣品瓶加壓時(shí)間10 s，定量環(huán)充滿時(shí)間10 s，進(jìn)樣時(shí)間10 s。

1.3.4.3 測定方法

將“1.3.4.1”項(xiàng)下制備獲得的血清放置至室溫，吸取0.20 mL于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，再加入叔丁醇0.80 mL，立即用硅膠將頂空進(jìn)樣瓶密封，放入恒溫爐中放置20 min，按上述色譜質(zhì)譜條件測定。

1.3.5 綠橘解酒飲對(duì)醉酒小鼠肝組織ADH、MDA和GSH的影響

將“1.3.4.1”項(xiàng)下的小鼠取血操作全部完成后，將所有小鼠斷頸處死，取出所有小鼠肝臟，冷PBS（4℃）洗凈后，用濾紙吸干水分，稱取肝臟0.5 g，冰水浴中使用組織搗碎勻漿機(jī)將肝臟制成勻漿，加入預(yù)冷的4.5 mL PBS中，混勻，3000 r/min離心15 min，提取上清液。按各試劑盒說明書操作測定上清液中ADH、MDA和GSH含量。

1.3.6 切片分析

取“1.3.5”項(xiàng)下各組剩余小鼠肝組織塊，用10%多聚甲醛固定，常規(guī)組織切片、蘇木精-伊紅染色法 (hematoxylin-eosin staining，HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，考察各組綠橘解酒飲對(duì)醉酒小鼠肝組織的保護(hù)情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采取SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析，測得的數(shù)據(jù)用平均值±SD表示，多重組間比較采用One Way Anova。p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.01為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)中測得的數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠耐酒精實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，當(dāng)小鼠的今世緣黃紀(jì)元酒灌胃劑量在0.25 mL/10 g時(shí)，醉酒率與存活率均為87.5%，效果較好。其余各組存在醉酒率較低或存活率較低的現(xiàn)象，不能滿足后續(xù)試驗(yàn)需求，故本實(shí)驗(yàn)確定使用42%vol今世緣黃紀(jì)元酒致小鼠醉酒劑量為0.25 mL/10 g。

表2 小鼠耐酒精實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 小鼠防醉與解酒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 小鼠防醉實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。由圖1可知，陽性對(duì)照組、綠橘解酒飲中、高劑量組的小鼠與模型組相比，睡眠潛伏時(shí)間與睡眠時(shí)間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05），而綠橘解酒飲低劑量組的睡眠潛伏時(shí)間與睡眠時(shí)間均與模型組不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05），表明綠橘解酒飲中、高劑量組預(yù)防小鼠醉酒的效果良好。

圖1 綠橘解酒飲的防醉實(shí)驗(yàn)小鼠的睡眠潛伏時(shí)間與睡眠時(shí)間

2.2.2 小鼠解酒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。由圖2可知，陽性對(duì)照組和綠橘解酒飲高劑量組小鼠的睡眠時(shí)間與模型組存在顯著性差異（p＜0.01），綠橘解酒飲中劑量組小鼠的解酒時(shí)間與模型組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05），低劑量組小鼠與模型組小鼠不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）。表明中、高劑量的綠橘解酒飲解酒效果較好。由防醉和解酒實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，綠橘解酒飲可以發(fā)揮較好的防醉與解酒作用，表現(xiàn)為醉酒發(fā)生延緩，持續(xù)時(shí)間短，且隨著劑量的增大，防醉和解酒作用均逐漸增強(qiáng)。此外，綠橘解酒飲防醉的睡眠時(shí)間顯著短于解酒的睡眠時(shí)間，表明綠橘解酒飲預(yù)防醉酒的效果要強(qiáng)于解酒效果。

圖2 綠橘解酒飲的解酒實(shí)驗(yàn)小鼠的睡眠時(shí)間

2.3 綠橘解酒飲對(duì)小鼠血液中乙醇濃度影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率與精密度的測定

取濃度為0.01 g/L、0.02 g/L、0.05 g/L、0.10 g/L、0.20 g/L、0.50 g/L、1.00 g/L、2.50 g/L和10.00 g/L的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以乙醇和叔丁醇定量離子的峰面積比值（y）對(duì)乙醇的質(zhì)量濃度（x）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性范圍為0.01～10.00 g/L，線性回歸方程為y=0.2179x-0.00208，相關(guān)系數(shù)為0.9998。分別取0.04 g/L、1.50 g/L和8.00 g/L乙醇溶液，每個(gè)濃度平行測定6次，回收率為99.16%～100.23%，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.3%，表明本文使用的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法可靠、可行。

2.3.2 血液中乙醇含量結(jié)果

各組小鼠灌胃1 h后，血液中乙醇含量測定結(jié)果見表3。與模型組比較，陽性對(duì)照組、綠橘解酒飲高劑量組存在顯著性差異（p＜0.01），中劑量組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05）。

表3 各組小鼠血液中乙醇含量測定結(jié)果

2.4 綠橘解酒飲對(duì)小鼠肝組織ADH、MDA和GSH影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）

如圖3所示，與空白對(duì)照組比較，綠橘解酒飲中、高劑量組的ADH、MDA和GSH水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05），陽性對(duì)照組的ADH水平存在顯著性差異（p＜0.01），且綠橘解酒飲的劑量越高，醉酒小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的ADH的水平越高，而MDA的水平逐漸降低。與模型組比較，陽性對(duì)照組，綠橘解酒飲高、中劑量組的ADH和MDA水平也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05），綠橘解酒飲的高劑量組與陽性對(duì)照組的GSH也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05），表明高、中劑量的綠橘解酒飲可以明顯提升醉酒小鼠的ADH與GSH水平，降低MDA的含量。

2.5 切片分析結(jié)果（圖4）

圖3 綠橘解酒飲對(duì)醉酒小鼠肝臟ADH、MDA和GSH的影響

圖4 醉酒小鼠肝臟組織的切片分析

由圖4可知，HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察，見模型組小鼠肝細(xì)胞小葉結(jié)構(gòu)排列紊亂，多數(shù)肝細(xì)胞內(nèi)可見大小不等的脂肪空泡，肝細(xì)胞出現(xiàn)氣球樣變，并伴有不同程度的肝細(xì)胞碎屑樣壞死和炎癥細(xì)胞浸潤，少數(shù)存在橋接壞死，部分出現(xiàn)匯管區(qū)輕度和中度炎癥。空白對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞未見明顯變性、壞死、無炎癥細(xì)胞浸潤。綠橘解酒飲各劑量組隨著劑量增大，醉酒小鼠肝臟變性，壞死及炎細(xì)胞浸潤程度顯著降低，這表明綠橘解酒飲具有較好的肝臟保護(hù)效果。

3 討論

眾所周知，過量飲酒后，乙醇在ADH作用下代謝為乙醛，該過程伴隨有大量氧自由基產(chǎn)生，使肝細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化劑GSH消耗增加，當(dāng)氧自由基的含量超過了GSH的抗氧化清除能力時(shí)，肝細(xì)胞膜會(huì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成肝細(xì)胞膜的氧化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的肝臟毒性[12]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，是反映脂質(zhì)過氧化程度的間接指標(biāo)[13]。因此，在飲酒后肝臟GSH含量越低、MDA含量越多，表明乙醇對(duì)肝臟損害的程度越大。此外，乙醛在體內(nèi)無法及時(shí)分解也會(huì)對(duì)肝臟等重要器官產(chǎn)生損傷。

RU21的解酒機(jī)理[14]為減緩乙醇氧化為乙醛，同時(shí)能加快乙醛的分解，快速有效的減少乙醛在血液中的含量。與RU21相比，本研究結(jié)果顯示中、高劑量的綠橘解酒飲能降低血液中的乙醇含量，提高醉酒小鼠體內(nèi)ADH的活性及肝臟中GSH的活力，亦可抑制肝臟中MDA的升高，表明綠橘解酒飲的作用機(jī)理是可能加速機(jī)體對(duì)乙醇的代謝，同時(shí)能較好地清除氧自由基和抗脂質(zhì)過氧化，降低肝臟中過氧化物含量，促進(jìn)乙醇的代謝。

現(xiàn)代社交離不開酒，在飲酒之前服用健康、安全的解酒產(chǎn)品逐漸成為一種自我保護(hù)措施。RU21雖然在解酒護(hù)肝方面展現(xiàn)出較好的效果，但是其屬于進(jìn)口商品，價(jià)格較高，消費(fèi)人群有限。綠橘解酒飲主要成分綠豆多肽與化橘紅，在國內(nèi)種植面積可觀，提取工藝簡單，成本遠(yuǎn)低于進(jìn)口的RU21，且綠橘解酒飲的解酒效果于肝保護(hù)作用較好，為其進(jìn)一步開發(fā)奠定了良好基礎(chǔ)。