尤小龍，黃永光，黃蘊(yùn)利，胡 峰，胡建鋒，鐘方達(dá)

(1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州茅臺(tái)酒廠（集團(tuán)）習(xí)酒有限責(zé)任公司，貴州習(xí)水564622）

放線菌是一類革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，主要菌絲體呈分枝狀。從Cohn發(fā)現(xiàn)放線菌至今已有100多年的歷史，1942年鏈霉素的發(fā)現(xiàn)，以及20世紀(jì)五六十年代抗生素工業(yè)的興起，極大地促進(jìn)了放線菌分類學(xué)研究的發(fā)展。這其中，土壤放線菌[1-3]、海洋放線菌[4-6]、植物內(nèi)生放線菌[7-9]和極端條件下放線菌[10-12]的研究報(bào)道較多。而在白酒釀造領(lǐng)域，放線菌的作用同樣不可忽視，放線菌對(duì)于白酒釀造過(guò)程中微生物群落的形成[13-14]，對(duì)白酒中化學(xué)成分的生成[15]，以及對(duì)于各種代謝產(chǎn)物多樣性的影響都是不可忽視的。近年來(lái)，白酒中對(duì)于放線菌的分離鑒定與群落觀察取得了很多成果[16-18]，放線菌對(duì)于白酒風(fēng)味影響的研究也不斷見(jiàn)諸報(bào)道[19-21]，但是對(duì)于白酒中放線菌生物活性的研究相對(duì)比較單薄。白酒釀造基礎(chǔ)核心是功能微生物因獨(dú)特的釀造環(huán)境發(fā)揮基礎(chǔ)作用和生物調(diào)節(jié)作用[22-23]，而放線菌在當(dāng)今學(xué)術(shù)領(lǐng)域的研究受到重視的重要原因之一就是因?yàn)榇蟛糠址啪€菌的代謝產(chǎn)物都具有生物調(diào)控作用。放線菌如果能在白酒的釀造環(huán)境中，代謝出可以影響其他功能細(xì)菌、酵母菌、霉菌的生物活性物質(zhì)，必然會(huì)對(duì)白酒釀造微生物的生長(zhǎng)、風(fēng)味物質(zhì)以及酒精的代謝甚至對(duì)整個(gè)微生態(tài)環(huán)境都產(chǎn)生很大的影響[24]。本研究通過(guò)研究醬香型白酒生產(chǎn)過(guò)程分離出的放線菌Streptomyces albusS5代謝產(chǎn)物的生物活性，并在此基礎(chǔ)上通過(guò)分離鑒定Streptomyces albusS5的生物活性化合物，初步闡明了Streptomyces albusS5的生物活性作用機(jī)制，研究結(jié)果可以用于分析放線菌Streptomyces albusS5與釀造環(huán)境其他功能微生物的生物學(xué)關(guān)系，解釋某些與放線菌有關(guān)的白酒釀造工藝科學(xué)原理，希望研究結(jié)果可以進(jìn)一步闡明放線菌在白酒中的主要作用，為改進(jìn)釀造工藝、提高白酒質(zhì)量甚至促進(jìn)白酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

菌株：Streptomyces albusS5，分離自茅臺(tái)鎮(zhèn)5000 t規(guī)模以上的醬香型白酒生產(chǎn)企業(yè)，現(xiàn)保存于本課題組重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；Baclicus lincheniformisB5，與Streptomyces albusS5分離自同一生境，其生長(zhǎng)較好且傳代性能穩(wěn)定，具有較明顯的醬香產(chǎn)香功能，保藏于本課題組重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；Wickerhamomyces anomalusY2，與Streptomyces albusS5分離自同一生境，生長(zhǎng)較好、傳代穩(wěn)定，并具有較強(qiáng)的產(chǎn)酒精能力，保藏于本課題組重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

試劑及耗材：蛋白胨、瓊脂粉、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、硫酸鎂、可溶性淀粉、明膠、重鉻酸鉀、氯化鈉、D-葡萄糖、無(wú)水乙醇、冰醋酸，以上試劑均為分析純。

儀器設(shè)備：恒溫振蕩搖床SHZ-82A、Beckman冷凍離心機(jī)Allegra,64R，上海智巖科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-2000E、生化培養(yǎng)箱SPX-250B，上海瑯玕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Waters 600型高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司。

1.2 培養(yǎng)基制備

放線菌種子培養(yǎng)基（g/L）：酵母膏10，葡萄糖5，KNO30.5，K2HPO40.25，MgSO4·7H2O 0.25，NaCl 0.25，F(xiàn)eSO40.25，可溶性淀粉 10，以 121 ℃滅菌20 min。

高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基（g/L）：KNO30.5，K2HPO40.25，MgSO4·7H2O 0.25，NaCl 0.25，F(xiàn)eSO40.25，可溶性淀粉 10，瓊脂20，121 ℃滅菌20 min。

高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基（g/L）：KNO30.5，K2HPO40.25，MgSO4·7H2O 0.25，NaCl 0.25，F(xiàn)eSO40.25，可溶性淀粉 10，121℃滅菌20 min。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（g/L）：NaCl 5，蛋白胨10，牛肉膏3，瓊脂20，121 ℃滅菌20 min。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（g/L）：NaCl 5，蛋白胨10，牛肉膏3，121 ℃滅菌20 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1Streptomyces albusS5代謝產(chǎn)物的富集

將Streptomyces albusS5在30℃、搖床轉(zhuǎn)速為230 r/min、發(fā)酵液裝液量為50 mL/250 mL、發(fā)酵時(shí)間為60 h的發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵，每一批發(fā)酵50瓶，共發(fā)酵50 L發(fā)酵液，發(fā)酵液處理方法如下：用Beckman冷凍離心機(jī)于4℃下冷凍離心20 min，分離上清液和沉淀菌絲。將上清液pH值調(diào)整至微堿性后，用乙酸乙酯等體積萃取2次后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1/200體積。菌絲用50 mL甲醇浸泡一夜，隔日用Beckman冷凍離心機(jī)于4℃下再次冷凍離心20 min，取甲醇上清液。合并處理過(guò)的上清液和處理過(guò)的菌絲浸泡液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1/200體積，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2Streptomyces albusS5代謝產(chǎn)物的分離

硅膠柱層析：將200～300目硅膠柱預(yù)處理后以濕法裝柱裝入30×400的層析柱，裝柱體積為柱體積的2/3，用乙酸乙酯-石油醚體系進(jìn)行洗脫，分別按濃度比例乙酸乙酯與石油醚體系分為2∶8、4∶6、6∶4、8∶2、純乙酸乙酯5個(gè)梯度，每個(gè)梯度洗脫體積均為200 mL，流速約為1 mL/min，每20 mL收集1次，收集得到的洗脫液利用薄層色譜法點(diǎn)板確認(rèn)成分，合并相同組分，減壓濃縮后進(jìn)行抑菌生物活性實(shí)驗(yàn)，合并有抑菌活性的組分繼續(xù)進(jìn)行下一步分離。

凝膠柱層析：將葡聚糖凝膠（sephadex）-LH20預(yù)處理后，以濕法裝柱裝入50×1200的層析柱中，待其中凝膠介質(zhì)穩(wěn)定后采取濕法上樣。凝膠層析柱使用氯甲體系進(jìn)行洗脫，洗脫液為二氯甲烷∶甲醇=1∶10，流速0.3 mL/min，每瓶收集3 mL，之后使用薄層色譜分析，并合并相同組分。

生物活性實(shí)驗(yàn)：用凝膠處理完后得到的洗脫液，對(duì)Baclicus lincheniformisB5與Wickerhamomyces anomalusY2進(jìn)行牛津杯實(shí)驗(yàn)確認(rèn)其生物活性。具體操作如下：平板培養(yǎng)基涂布之后，取1個(gè)內(nèi)徑為6 mm的無(wú)菌牛津杯平穩(wěn)放置，向杯中注入150 μL用1.3.1方法處理的Streptomyces albusS5發(fā)酵液，空白對(duì)照組采用分析純的甲醇加入牛津杯，培養(yǎng)3 d，每1個(gè)平行樣處理3次，培養(yǎng)48 h后用十字交叉法測(cè)量抑菌圈，結(jié)果取3個(gè)平行樣的平均值。

1.3.3Streptomyces albusS5代謝產(chǎn)物的鑒定

將含有活性物質(zhì)的洗脫液進(jìn)行紫外掃描后，在對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)下進(jìn)行HPLC實(shí)驗(yàn)，結(jié)合LC-MS進(jìn)行Streptomyces albus S5代謝活性物質(zhì)分子量的解析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Streptomyces albus S5代謝產(chǎn)物生物活性成分分析

2.1.1Streptomyces albus S5代謝產(chǎn)物的生物活性確認(rèn)

Baclicus lincheniformisB5和Wickerhamomyces anomalusY2牛津杯實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，StreptomycesalbusS5的代謝活性產(chǎn)物對(duì)Baclicus lincheniformisB5有明顯生物活性，而對(duì)Wickerhamomyces anomalusY2卻未表現(xiàn)出生物活性，這說(shuō)明菌株S5的代謝產(chǎn)物中有生物活性的成分，對(duì)細(xì)菌有較強(qiáng)的生物活性，而對(duì)酵母菌此類真菌并沒(méi)有明顯影響。

圖1 Streptomyces albusS5層析洗脫液的抑菌結(jié)果

2.1.2 洗脫液衍生化后進(jìn)行HPLC分析

Streptomyces albusS5代謝的活性物質(zhì)經(jīng)全紫外掃描并未發(fā)現(xiàn)紫外特異吸收峰，這說(shuō)明具有生物活性的組分沒(méi)有能對(duì)紫外產(chǎn)生吸收的基團(tuán)，如果要用高效液相對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)其進(jìn)行衍生化后產(chǎn)生具有紫外吸收的基團(tuán)，才能用HPLC進(jìn)行分析。Streptomyces albusS5的代謝活性產(chǎn)物對(duì)細(xì)菌作用明顯，對(duì)酵母無(wú)顯著作用，分析其極可能為聚醚類抗生素，用聚醚類抗生素的衍生方法衍生后進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

衍生化條件：取抑菌液700 μL，加入100 μL三氯醋酸水溶液（500 mg/mL），混旋20 s，放置10 min后加入200 μL二硝基苯肼甲醇溶液（1 mg/mL），混旋20 s后在55℃中水浴30 min，冷卻后上機(jī)。用安捷倫高效液相色譜儀進(jìn)行液相分析，液相條件如下：甲醇∶1.5%醋酸水溶液=90∶10，流速1 mL/min，柱溫30℃，波長(zhǎng)392 nm。高效液相色譜結(jié)果如圖2。

用未衍生的洗脫液，衍生后的洗脫液，以及沒(méi)有加入洗脫液的純衍生液分別上樣，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，結(jié)果顯示，未衍生的洗脫液主要在保留時(shí)間3 min之前，峰形混亂，分析其為雜質(zhì)峰；純衍生液僅在2 min有明顯峰形，分析其為衍生液和雜質(zhì)的混合峰；衍生過(guò)的洗脫液，在12 min和15.7 min都有明顯峰形，綜合分析結(jié)果表明，保留時(shí)間為15.7 min的物質(zhì)就是Streptomyces albusS5代謝活性物質(zhì)，經(jīng)過(guò)查閱相關(guān)資料也與其他研究中得到的結(jié)果相似，根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以將Streptomyces albusS5的活性代謝產(chǎn)物衍生后用HPLC檢測(cè)。

圖2 Streptomyces albusS5未衍生洗脫液，衍生過(guò)的洗脫液，純衍生液高效液相色譜圖

2.1.3Streptomyces albusS5活性代謝產(chǎn)物的LCMS分析

對(duì)Streptomyces albusS5代謝的活性物質(zhì)進(jìn)行LC-MS分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。在電子流較強(qiáng)的信號(hào)段，離子碎片的質(zhì)荷比（m/z）主要有773.5和789.5，結(jié)合LC-MS工作原理，Streptomyces albusS5代謝活性產(chǎn)物的分子在自身基礎(chǔ)上去掉一個(gè)氫離子，加上一個(gè)鈉離子，得到分子量為751-1+23=773，去掉氫離子加上一個(gè)鉀離子得到分子量為751-1+39=789，分析可得Streptomyces albusS5代謝活性產(chǎn)物分子量是751。此外，質(zhì)譜圖中幾乎沒(méi)有顯示代謝活性產(chǎn)物本身的分子量為751，說(shuō)明該Streptomyces albusS5代謝活性產(chǎn)物極容易和金屬離子結(jié)合，這也是聚醚類抗生素的一個(gè)特征。

根據(jù)上述結(jié)果，Streptomyces albusS5代謝活性產(chǎn)物比起酵母菌對(duì)細(xì)菌作用更加明顯，無(wú)紫外吸收基團(tuán)，分子量大致為751，Streptomyces albusS5經(jīng)分子鑒定，是白色鏈霉菌(Streptomyces albus)，綜合上述結(jié)果進(jìn)行相關(guān)資料查閱，分析Streptomyces albusS5代謝活性產(chǎn)物極可能是鹽霉素（Salinomy-cin）。

那此產(chǎn)物到底是否為鹽霉素（Salinomycin），還需要下一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

圖3 Streptomyces albusS5液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)結(jié)果

2.2 Streptomyces albusS5代謝活性產(chǎn)物成分驗(yàn)證

2.2.1 內(nèi)標(biāo)法確認(rèn)成分

根據(jù)前面的結(jié)論，分析Streptomyces albusS5極可能是鹽霉素（Salinomycin），將鹽霉素標(biāo)樣配制成濃度為600 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，用2.1.2中的衍生方法處理過(guò)后，Streptomyces albusS5代謝活性物質(zhì)的衍生液中，再進(jìn)行HPLC，監(jiān)測(cè)保留時(shí)間15.7 min的峰形如何發(fā)生變化，HPLC結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4表明，加入鹽霉素標(biāo)樣后，原保留時(shí)間15.7min的峰形明顯增大（實(shí)驗(yàn)過(guò)程中硅膠柱內(nèi)壓發(fā)生了變化，所以導(dǎo)致原15.7 min保留時(shí)間的目標(biāo)峰略微向后漂移，不過(guò)經(jīng)過(guò)反復(fù)核對(duì)分析，此現(xiàn)象對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果并未造成影響），說(shuō)明加入的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)使Streptomyces albusS5活性代謝產(chǎn)物濃度發(fā)生了改變，內(nèi)標(biāo)物鹽霉素，正是Streptomyces albusS5的代謝活性產(chǎn)物。比對(duì)加入標(biāo)樣前后的色譜圖，可以發(fā)現(xiàn)，從Streptomyces albusS5發(fā)酵液中提取的代謝產(chǎn)物的濃度，低于加入標(biāo)樣的濃度（600 μg/mL）。

2.2.2Streptomyces albusS5洗脫液中活性物質(zhì)濃度確認(rèn)

將鹽霉素標(biāo)樣配制成不同濃度的溶液，衍生化后進(jìn)行HPLC實(shí)驗(yàn)，部分高效液相色譜結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖4 樣品內(nèi)標(biāo)法液相色譜圖

圖5 不同濃度標(biāo)樣高效液相色譜圖

由圖5可知，隨著鹽霉素標(biāo)樣濃度的升高，峰形也有顯著增大，具體鹽霉素濃度與峰面積對(duì)應(yīng)關(guān)系如下：衍生過(guò)的洗脫液峰面積為1852，400 μg/mL的峰面積為4006，500 μg/mL的峰面積為4486，600 μg/mL的峰面積為5914，700 μg/mL的峰面積為6753，800 μg/mL的峰面積為7863，900 μg/mL的峰面積為8759。以此數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖6）：y=9.5814x+135.73，其中y為峰面積，x為濃度值（μg/mL），將衍生過(guò)的洗脫液峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算得到洗脫液中鹽霉素濃度為174 μg/mL，并以此濃度進(jìn)行Streptomyces albusS5鹽霉素產(chǎn)量的推算：174 μg/mL的鹽霉素溶液有30 mL，由Streptomyces albusS5發(fā)酵液50 L處理得到，查閱相關(guān)資料估算乙酸乙酯萃取收率在50%，Streptomyces albusS5發(fā)酵液中鹽霉素的濃度約為210 μg/L，一些研究中經(jīng)過(guò)誘變的鹽霉素高產(chǎn)白色鏈霉菌發(fā)酵液中的鹽霉素濃度甚至可以達(dá)到20 mg/mL[25]，與之相比，Streptomyces albusS5的鹽霉素產(chǎn)率很低，主要原因是菌種和環(huán)境的差異，即使本來(lái)有鹽霉素產(chǎn)率很高的白色鏈霉菌在白酒釀造環(huán)境中經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期變異與質(zhì)粒交換，其產(chǎn)鹽霉素的產(chǎn)率也會(huì)大大降低。鹽霉素對(duì)一些對(duì)其極為敏感的芽孢桿菌的最低抑制濃度約為 0.25 μg/mL[26]，略高于Streptomyces albusS5的鹽霉素產(chǎn)量，故Streptomyces albusS5對(duì)于白酒釀造環(huán)境雖然會(huì)有一定影響，但是不會(huì)造成毀滅性的破壞。

用活性實(shí)驗(yàn)對(duì)Streptomyces albusS5的代謝活性產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線洗脫液中Streptomyces albusS5代謝的鹽霉素濃度為174 μg/mL，如果與相同濃度鹽霉素標(biāo)品一起進(jìn)行活性實(shí)驗(yàn)并且能得到相似的結(jié)果，那么就進(jìn)一步證明，Streptomyces albusS5的代謝活性產(chǎn)物就是鹽霉素（Salinomycin）。

圖6 鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線

將鹽霉素標(biāo)樣配制成為不同濃度溶液，與Streptomyces albusS5洗脫液同時(shí)進(jìn)行活性實(shí)驗(yàn)，部分活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。經(jīng)過(guò)十字交叉法測(cè)量，在濃度為 100 μg/mL、200 μg/mL、500 μg/mL的鹽霉素標(biāo)樣抑菌圈直徑分別為8 mm、16 mm、31 mm，而洗脫液的抑菌圈直徑為15 mm。在牛津杯實(shí)驗(yàn)中，洗脫液得到了與200 μg/mL的鹽霉素標(biāo)樣相似的結(jié)果，而經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算Streptomyces albusS5的代謝活性物質(zhì)在洗脫液中濃度為174 μg/mL時(shí)，也與200 μg/mL相近，這說(shuō)明生物活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與HPLC實(shí)驗(yàn)結(jié)果互相對(duì)應(yīng)，共同證明了Streptomyces albusS5代謝活性產(chǎn)物成分為鹽霉素（Salinomycin），并且在洗脫液中，其濃度約為174 μg/mL。

圖7 不同濃度鹽霉素標(biāo)樣生物活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)Streptomyces albusS5代謝產(chǎn)物的硅膠柱分離、凝膠柱分離，對(duì)其進(jìn)行活性驗(yàn)證后通過(guò)LC-MS和衍生化后HPLC分析其具體成分，得到結(jié)論如下：Streptomyces albusS5代謝活性物質(zhì)細(xì)菌較顯著，對(duì)酵母菌這類真菌效果較差，無(wú)紫外吸收基團(tuán)，衍生化后結(jié)合LC-MS得知其分子量為751，極易與金屬離子結(jié)合，綜合分析其為鹽霉素（Salinomycin）。經(jīng)過(guò)內(nèi)標(biāo)法與活性實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，Streptomyces albusS5代謝的生物活性物質(zhì)確實(shí)為鹽霉素（Salinomycin），Streptomyces albusS5通過(guò)液體發(fā)酵的鹽霉素的產(chǎn)率約為210 μg/L。