王學(xué)文，郝佳潔，周 菲，孫曉男，常 晨，蔡 巖，徐 昕，王明榮，賈雪梅

肺腺癌是肺癌的一種，且是最常見的一種病理類型。在中國，肺癌是發(fā)病率最高的腫瘤也是癌癥死因之首。根據(jù)其組織學(xué)特點(diǎn)，肺癌可分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小細(xì)胞肺癌，肺腺癌屬于NSCLC[1]。不同類型的肺癌治療方法不同，準(zhǔn)確判斷腫瘤的病理分型非常重要。天冬氨酸蛋白酶A(novel aspartie proteinase A, Napsin A)是天門冬氨酸蛋白酶家族成員，參與表面活性物質(zhì)蛋白的水解過程，起到誘導(dǎo)蛋白前體成熟、維持肺的形態(tài)及正常功能的作用。Napsin A 在Ⅱ型肺泡上皮和原發(fā)性肺腺癌中有特異性表達(dá)[2]。表面活性蛋白A(surfactant protein A, SP-A)是肺表面活性物質(zhì)重要組成成分，屬于C型凝集素家族重要成員，在維持表面活性劑的穩(wěn)定和防御呼吸道病原體中起著重要的作用[3]。Napsin A蛋白和SP-A蛋白常用于肺腺癌的診斷和鑒別診斷[4-6]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是人表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor, HER)家族成員之一，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分組成。EGFR信號通路對細(xì)胞的生長、增殖和分化等生理過程發(fā)揮重要的作用。EGFR基因突變狀態(tài)是晚期NSCLC最重要的療效預(yù)測因子和選擇治療方式的分子指標(biāo)，是肺癌靶向藥物治療的靶點(diǎn)之一[7-8]。該文研究了肺腺癌組織中Napsin A蛋白和SP-A蛋白的表達(dá)及EGFR基因突變情況，分析其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為肺腺癌的診斷和預(yù)后提供幫助。

1 材料與方法

1.1病例資料本研究使用的216例肺腺癌組織以及同一患者手術(shù)切緣形態(tài)學(xué)正常的肺組織均為臨床診斷后剩余的標(biāo)本，取自2005年～2012年于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院接受手術(shù)治療的原發(fā)肺腺癌患者，所有患者簽署了知情同意書，該項研究經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(審批號12-098/632)。所有患者手術(shù)前未經(jīng)過放療和化療，均經(jīng)組織病理學(xué)診斷為肺腺癌。其中男113例，女103例；年齡32～78歲，中位年齡58.5歲。T1期29例，T2期125例，T3期38例，T4期24例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移146例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況不詳1例。腫瘤分期按照UICC第7版TNM分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，Ⅰ期48例，Ⅱ期43例，Ⅲ期109例，Ⅳ期16例。其中有完整隨訪記錄病例210例，死亡病例48例，隨訪時間1～63個月，中位隨訪時間25個月。

1.2主要試劑與儀器鼠抗人Napsin A單克隆抗體(克隆號IP64)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；鼠抗人SP-A單克隆抗體(克隆號PE10)(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；PV9000免疫組織化學(xué)檢測試劑盒及濃縮型DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；冰凍組織DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)；PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；PCR儀(美國ABI公司)；電泳儀(美國Bio-rad公司)；NanoDrop 2000C紫外分光光度計(美國Thermo公司)。

1.3組織微陣列制備將取得的組織標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片和HE染色，經(jīng)過顯微鏡閱片，每例針對手術(shù)切緣取2個點(diǎn)(正常肺組織形態(tài))以及各區(qū)域腫瘤組織取3個點(diǎn)(共5個點(diǎn))，并將相應(yīng)組織點(diǎn)在蠟塊上標(biāo)記。利用穿刺針將供體蠟塊轉(zhuǎn)移至受體蠟塊，制作成組織微陣列。切片厚度為4 μm。

1.4免疫組化組織微陣列切片常規(guī)脫蠟至水，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗滌，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶15 min，高壓抗原修復(fù)，37 ℃一抗孵育1 h，PBS洗，依次滴加PV9000免疫組化試劑盒中的聚合物輔助劑和酶標(biāo)山羊抗鼠/兔IgG聚合物，37 ℃下分別孵育20 min和30 min。二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine, DAB)顯色，蘇木精復(fù)染，自來水返藍(lán)，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。

1.5冰凍組織基因組DNA提取從-80 ℃冰箱中取出組織，切取肺腺癌腫瘤組織及手術(shù)切緣組織各25 mg，分別置于1.5 ml的Eppendorf管中，提取基因組DNA操作流程按QIAamp DNA Mini試劑盒(Cat No.51304)說明書進(jìn)行。

1.6EGFR基因目的片段PCR擴(kuò)增及測序使用NanoDrop 2000C紫外分光光度計檢測基因組DNA的質(zhì)量和濃度，并用無DNase水稀釋至20 ng/μl作為模版。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液2 μl，dNTP混合液(2.5 mmol/L)1.6 μl，引物(10 μmol/L)1 μl，模板DNA(20 ng/μl)1 μl，rTaq DNA聚合酶0.2 μl，去離子水14.2 μl。反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火5 s，72 ℃延伸50 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。EGFR基因19外顯子引物序列：F：5′-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3′，R：5′-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-3′；EGFR基因21外顯子引物序列：F：5′-CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC-3′，R：5′-GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG-3′。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司合成。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送至北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.7免疫組化結(jié)果及基因突變結(jié)果判斷參照相應(yīng)文獻(xiàn)[9]及目前比較成熟的美國FDA推薦的免疫組化結(jié)果評分系統(tǒng)(Dako, HercepTestTMInterpretation Manual)，制定評分標(biāo)準(zhǔn)。免疫組織化學(xué)染色以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕色狀染色為陽性，對陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評分。按染色強(qiáng)度評分：無染色0分，淺棕色1分，中度著色2分，深棕色3分。按陽性細(xì)胞百分比評分：陽性細(xì)胞百分比<10%為1分，10%≤陽性細(xì)胞百分比<50%為2分，50%≤陽性細(xì)胞百分比<80%為3分，陽性細(xì)胞百分比≥80%為4分。根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比評分之積進(jìn)行總體評分。每例3個區(qū)域腫瘤位點(diǎn)分別進(jìn)行評分，取3個腫瘤位點(diǎn)的平均分為最終評分。最終評分<1分為陰性，≥1分定義為陽性。EGFR基因突變的判斷，使用BioEdit軟件讀取序列圖譜和堿基序列。癌組織和配對的手術(shù)切緣組織序列進(jìn)行對比，并將結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST對比，最終確定標(biāo)本中EGFR基因是否突變。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用軟件SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗、配對χ2檢驗，采用Kaplan-Meier方法分析Napsin A蛋白和SP-A蛋白表達(dá)情況與患者術(shù)后總生存之間的關(guān)系，并通過Cox比例風(fēng)險模型分析不同臨床病理參數(shù)和Napsin A、SP-A蛋白表達(dá)情況對肺腺癌患者術(shù)后生存時間的影響。檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1NapsinA蛋白在肺腺癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系免疫組化結(jié)果顯示，Napsin A蛋白在腫瘤組織中陽性表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，陽性率為74.5%(161/216)；手術(shù)切緣肺組織中，陽性表達(dá)位于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)(圖1)。Napsin A蛋白表達(dá)情況與肺腺癌患者的年齡、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性(表1)。

2.2SP-A蛋白在肺腺癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系免疫組化結(jié)果顯示，SP-A蛋白在腫瘤組織中陽性表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，陽性率為34.3%(74/216)，在手術(shù)切緣組織中不表達(dá)(圖2)。SP-A蛋白表達(dá)與肺腺癌患者的年齡、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性(表1)。

圖1 Napsin A蛋白在肺腺癌組織和手術(shù)切緣組織的表達(dá) ×200

A：手術(shù)切緣組織中Ⅱ型肺泡細(xì)胞中等陽性；B：癌組織弱陽性；C：癌組織中等陽性；D：癌組織強(qiáng)陽性

2.3NapsinA和SP-A蛋白與肺腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性Kaplan-Meier生存分析顯示，Napsin A蛋白陽性的肺腺癌患者生存時間長于Napsin A蛋白陰性患者(P=0.003)(圖3)，SP-A蛋白表達(dá)情況與術(shù)后生存時間無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性。Cox多因素回歸分析顯示，Napsin A蛋白表達(dá)是肺腺癌患者預(yù)后良好的一個獨(dú)立預(yù)測因素(P=0.002)，見表2。

圖2 SP-A蛋白在肺腺癌組織和手術(shù)切緣組織的表達(dá) ×200

A：手術(shù)切緣組織中陰性；B：癌組織弱陽性；C：癌組織中等陽性；D：癌組織強(qiáng)陽性

圖3 Napsin A蛋白表達(dá)與肺腺癌患者術(shù)后生存時間的關(guān)系

臨床病理指標(biāo)nNapsin A蛋白陽性例數(shù)陰性例數(shù)χ2值P值SP-A蛋白陽性例數(shù)陰性例數(shù)χ2值P值年齡(歲) ≥6010076240.2100.64732680.4220.516 <6011685314274性別 男11379342.6710.10236770.6060.436 女10382213865吸煙情況 是8865230.0350.43629590.1120.738 否12896324583T分期 T1～T2154119352.1160.146541000.1550.694 T3～T46242202042淋巴轉(zhuǎn)移 有147110370.0210.88550970.0120.912 無6951182445臨床分期 Ⅰ～Ⅲ199146531.1250.289651342.8590.091 Ⅳ1715298

表2 肺腺癌患者術(shù)后生存時間的Cox回歸分析

圖4 肺腺癌組織中EGFR基因19外顯子和21外顯子野生型與突變型序列峰圖

2.4EGFR基因突變情況與肺腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系45例肺腺癌組織EGFR基因突變率為31.1%(14/45)，其中19外顯子突變率為16.3%(7/43)，均為缺失突變。21外顯子突變率為17.8%(8/45)，均為L858R點(diǎn)突變(圖4)。沒有19外顯子與21外顯子同時發(fā)生突變的病例。EGFR基因突變與肺腺癌患者的年齡、T分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等臨床病理特征無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性(表3)。

2.5肺腺癌組織中NapsinA和SP-A蛋白的表達(dá)、EGFR基因突變的相關(guān)性Napsin A蛋白在腫瘤組織中的陽性率為74.5%(161/216)，SP-A蛋白在腫瘤組織的陽性率34.3%(74/216)。Napsin A蛋白在肺腺癌中的陽性率高于SP-A蛋白，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見表4。Napsin A蛋白表達(dá)陽性者，SP-A蛋白的陽性率為42.9%(69/161)；Napsin A蛋白表達(dá)陰性者，SP-A蛋白的陽性率為9.1%(5/55)。

表3 EGFR基因突變情況與肺腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系(n)

表4 Napsin A、SP-A蛋白陽性率分析(n)

Napsin A蛋白陽性者EGFR基因突變率為41.7%(15/36)，Napsin A蛋白陰性者，沒有病例發(fā)生EGFR基因突變。SP-A蛋白陽性者EGFR基因突變率為33.3%(5/15)，SP-A蛋白陰性者EGFR基因突變率為33.3%(10/30)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Napsin A蛋白表達(dá)陽性病例EGFR基因突變率較表達(dá)陰性病例突變率高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.020)，見表5。

表5 Napsin A、SP-A蛋白的表達(dá)與EGFR突變的相關(guān)性(n)

*Fisher精確檢驗

3 討論

EGFR突變主要發(fā)生于18～21外顯子，其中19外顯子缺失突變和21外顯子點(diǎn)突變是最常見的[13-14]。該研究中EGFR基因突變的患者，Napsin A蛋白表達(dá)均為陽性。盡管該相關(guān)性還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗證，但作為一個重要提示，對Napsin A蛋白陽性的患者可進(jìn)行EGFR基因突變的檢測，為應(yīng)用EGFR靶向藥物進(jìn)行個體化治療提供依據(jù)，以期提高肺癌患者的生存質(zhì)量。

目前在肺癌的早期診斷方面并沒有很理想的方法，肺癌的惡性程度高，腫瘤進(jìn)展迅速。有文獻(xiàn)[15]報道，肺癌確診時已有40%的患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，錯過了最佳的手術(shù)時機(jī)。肺癌的治療方法有手術(shù)、放療、化療及靶向藥物治療等。肺癌患者臨床診療中首先要確定肺癌的亞型分類，才能采取相應(yīng)的治療方法。免疫組化技術(shù)和基因檢測技術(shù)常用來確定腫瘤的亞型和分子分型。該研究結(jié)果提示，Napsin A蛋白陽性表達(dá)有助于肺腺癌亞型的診斷，Napsin A蛋白陽性表達(dá)的肺腺癌患者其預(yù)后較好。而且，Napsin A蛋白陽性患者檢測出EGFR基因突變的概率較高，有可能應(yīng)用于基于EGFR基因突變的肺癌靶向治療。