馬云艷

【摘 要】根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法要求，建立乳酸細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。通過(guò)預(yù)干擾試驗(yàn)，確定乳酸最終濃度為0.4mg/ml以下，選取濃度為0.2mg/ml，對(duì)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素之間的聚集反應(yīng)無(wú)干擾作用。故該方法可作為乳酸的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法使用。

【關(guān)鍵詞】乳酸；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

乳酸純品為無(wú)色液體，無(wú)氣味，具有吸濕性，能與水、乙醇、甘油混溶。在食品、醫(yī)藥、工業(yè)、化妝品、農(nóng)產(chǎn)品及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。本文中乳酸作為地佐辛注射液及雷莫司瓊注射液的藥用輔料使用，選用湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)的鱟試劑進(jìn)行預(yù)干擾試驗(yàn)，然后用兩個(gè)鱟試劑生產(chǎn)廠家即湛江安度斯生物有限公司和湛江博康海洋生物有限公司，分別進(jìn)行干擾試驗(yàn)。通過(guò)本試驗(yàn)研究了解乳酸對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)的適用性，為制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)提供試驗(yàn)依據(jù)。

一、儀器及試驗(yàn)試劑

（一）儀器

內(nèi)毒素凝膠法測(cè)定議

漩渦混合器

移液器

（二）試劑、無(wú)熱原吸頭

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品 10EU/ml 批號(hào)：1704260 購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 內(nèi)毒素含量<0.003EU/ml 批號(hào)：1703030購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司

鱟試劑 0.25EU/ml 批號(hào)：1704102購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司

鱟試劑 0.25EU/ml 批號(hào)：1608110購(gòu)自湛江博康海洋生物有限公司

鱟試劑 0.125Eu/ml 批號(hào)：1609200購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司

鱟試劑 0.06Eu/ml 批號(hào)：1608012購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司

稀釋劑Ⅱ 批號(hào)：1701120購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司

無(wú)熱原吸頭（250ul） 批號(hào)： 1702280購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司

無(wú)熱原吸頭（1000ul） 批號(hào)： 1612130購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司

（三）樣品信息

乳酸 批號(hào)171001 無(wú)錫某制藥有限公司

二、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法

（一）細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定

依據(jù)地佐辛注射液說(shuō)明書的用法用量計(jì)算乳酸限值（10EU/mg），雷莫司瓊注射液說(shuō)明書的用法用量計(jì)算乳酸限值（75EU/mg）綜合考慮，以最小值取四倍安全系數(shù)，確定乳酸細(xì)菌內(nèi)毒素限值為2.5EU/mg。

（二）鱟試劑靈敏度符合

按照《中國(guó)藥典》2015年版四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定，進(jìn)行鱟試劑靈敏度符合，結(jié)果均符合規(guī)定。

（三）預(yù)試驗(yàn)

1.試驗(yàn)過(guò)程

現(xiàn)有的鱟試劑濃度為0.25Eu/ml、0.125Eu/ml、0.06Eu/ml。乳酸有效稀釋濃度（MVC）范圍按公式MVC=λ/L，L=2.5Eu/mg。計(jì)算可知，乳酸最低有效濃度為0.024～0.1mg/ml。選取0.25Eu/ml的鱟試劑進(jìn)行預(yù)干擾試驗(yàn)。

取1ml乳酸稱重約為1.2g，即為1200mg/ml的供試品原液，以稀釋劑Ⅱ?qū)┰嚻吩哼M(jìn)行稀釋，將此系列濃度記為S。同時(shí)在上述溶液中加入細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使每一濃度的溶液中均含0.5Eu/ml濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素，將此系列溶液記為SE，取鱟試劑0.25EU/ml與上述相應(yīng)S和SE反應(yīng)，每一濃度重復(fù)做兩管，并設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，在S均為陰性，陽(yáng)性、陰性對(duì)照為陽(yáng)性和陰性的情況下，選取開(kāi)始出現(xiàn)陽(yáng)性的SE所對(duì)應(yīng)濃度的下一級(jí)濃度為MVC。結(jié)果如下：

通過(guò)預(yù)干擾試驗(yàn)，在濃度為0.4mg/ml下無(wú)干擾，選取下一濃度，即0.2mg/ml為不干擾濃度進(jìn)行試驗(yàn)。

（四）正式干擾實(shí)驗(yàn)

為了最終確認(rèn)是否存在干擾因素的影響，進(jìn)行以下正式干擾試驗(yàn)。取供試樣品用稀釋劑Ⅱ進(jìn)行稀釋，使其最終無(wú)干擾試驗(yàn)稀釋濃度為0.2mg/ml，按《中國(guó)藥典》2015年版四部通則1143中的“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法干擾試驗(yàn)項(xiàng)”進(jìn)行試驗(yàn)。

結(jié)果如下：

鱟試劑廠家：湛江博康海洋生物有限公司 λ=0.25EU/ml

鱟試劑廠家： 湛江安度斯生物有限公司 λ=0.25EU/ml

正式干擾試驗(yàn)結(jié)果表明：0.2mg/ml稀釋液對(duì)Et均在0.5ES～2.0ES范圍內(nèi)，確認(rèn)無(wú)干擾影響。

（五）供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)

按《中國(guó)藥典》2015年版四部通則1143中“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”使用兩個(gè)廠家的鱟試劑分別對(duì)供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果均符合規(guī)定。

三、討論

（一）通過(guò)預(yù)干擾試驗(yàn)結(jié)果表明，湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)的鱟試劑與供試品在0.4mg/ml稀釋液以下濃度范圍內(nèi)反應(yīng)無(wú)干擾作用。

（二）正式干擾試驗(yàn)選用0.2mg/ml供試品稀釋液，與兩個(gè)廠家的鱟試劑反應(yīng)結(jié)果Et均在0.5ES～2ES范圍內(nèi)，確認(rèn)無(wú)干擾影響。內(nèi)毒素限值若為2.5EU/mg，則稀釋液濃度在0.2mg/ml以下，一般不會(huì)產(chǎn)生干擾影響，可以完成正常檢測(cè)。

（三）細(xì)菌內(nèi)毒素表述為：取本品，依法檢查（《中國(guó)藥典》2015年版四部通則1143），每1mg乳酸中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于2.5EU。