王凱乾， 曾 艷， 陳榮生， 梁 峰

(武漢科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，湖北武漢 430081)

鋅是一種重要的微量元素，它在人體內(nèi)的含量?jī)H次于鐵[1]。鋅對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)，發(fā)育和體內(nèi)平衡、轉(zhuǎn)錄、分裂、氧化應(yīng)激、衰老和凋亡有著重要的影響，對(duì)精子生成和胎兒生長(zhǎng)以及人體適當(dāng)?shù)墓堑V化，血液凝固和認(rèn)知功能都具有關(guān)鍵的作用[2]。因此對(duì)Zn2+的檢測(cè)，尤其是活體細(xì)胞和組織中Zn2+的測(cè)定已成為近年來(lái)生物化學(xué)家非常關(guān)注的領(lǐng)域。

目前Zn2+檢測(cè)的常用方法有電化學(xué)檢測(cè)法[3 - 5]、熒光法[6 - 12]以及電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)[13 - 14]。其中，電化學(xué)方法大多需要嚴(yán)格的預(yù)處理且干擾因素多，ICP-AES操作比較復(fù)雜，且需要一定的耗能，成本較高。而熒光化學(xué)傳感器法是目前公認(rèn)的一種高效、快速的金屬離子的檢測(cè)方法，但是在傳統(tǒng)的熒光化學(xué)傳感器中，作為連接單元的有機(jī)物存在合成程序復(fù)雜，水溶性差，熒光漂白易于失活以及選擇性差等問(wèn)題。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)金納米粒子(Au-NPs)具有表面等離子體共振(LSPR)消光系數(shù)大，穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，使得它可以代替有機(jī)分子成為制造熒光化學(xué)傳感器的支架單元。

Daniela等人[15]將強(qiáng)熒光物質(zhì)羅丹明B(RhB)連接到Au-NPs表面構(gòu)建了一種開(kāi)啟式的熒光傳感器來(lái)檢測(cè)Zn2+并取得了較好的效果。本文采用種子生長(zhǎng)法[16]制備的金納米星(Au-NSs)和羅丹明B來(lái)構(gòu)建熒光傳感器，通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，Zn2+的最低檢測(cè)濃度可達(dá)到0.013 mg/L。與已有的方法相比，本文所使用的方法不需要進(jìn)行復(fù)雜的前體制備，不需要嚴(yán)格的預(yù)處理，不需要大量的耗能，且操作更為簡(jiǎn)單快捷，效率更高，測(cè)量范圍從0.2 μmol/L跨越到5 mmol/L，且相對(duì)于其他過(guò)渡態(tài)金屬離子而言，對(duì)Zn2+有著較好的選擇性，具有更大的應(yīng)用潛力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器及試劑

UV-3600紫外近紅外分光光度計(jì)(日本，島津公司)；LS-55熒光分光光度計(jì)(上海珀金埃爾默有限公司)；BSA124S電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；KQ2200D數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MS-H-Pro+數(shù)顯加熱型磁力攪拌器(北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

HAuCl4·4H2O(Au≥47.8%，Sigma-Aldrich)，二水合檸檬酸三鈉(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，AgNO3(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，抗壞血酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，羅丹明B(RhB)(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。金屬離子Zn2+、Mn2+、Cu2+、Co2+和Ni2+的溶液均由它們的乙酸鹽(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)配制。實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.120nmAu-NPs的制備向三口燒瓶中加入25 mL HAuCl4水溶液(1 mmol/L)，加熱至100 ℃后，在500 r/min的攪拌速度下逐滴加入4 mL檸檬酸鈉水溶液(38 mmol/L)，并持續(xù)反應(yīng)15 min，停止攪拌，待樣品降至室溫后，置于4 ℃冷藏保存。

1.2.280nmAu-NSs的制備以制備的20 nm Au-NPs為金種，利用種子生長(zhǎng)法制備尺寸約為80 nm Au-NSs。向60 mL HAuCl4水溶液(0.25 mmol/L)中依次加入0.6 mL HCl(1 mol/L)，0.6 mL金種，0.6 mL AgNO3水溶液(3 mmol/L)和0.3 mL抗壞血酸水溶液(0.1 mol/L)，整個(gè)過(guò)程在700 r/min的攪拌速率下進(jìn)行[17]。在這方面本課題組進(jìn)行了大量的研究[18 - 21]。

1.2.3熒光傳感器在不同條件下的紫外-可見(jiàn)-近紅外光譜先通過(guò)紫外分光光度法測(cè)定制備的80 nm Au-NSs 和羅丹明B水溶液的最大吸收波長(zhǎng)及吸光度，再取多份濃度為5 μmol/L的羅丹明B溶液1 mL，依次向該溶液中加入1、2、3、4 mL的Au-NSs，加蒸餾水定容至5 mL，觀察各樣品紫外光譜的變化情況。取多份濃度為5 μmol/L的羅丹明B溶液1 mL，同時(shí)向所有樣品中加入2 mL Au-NSs，然后分別向其中依次加入0.02、0.05、0.1、0.5、2.0 mL濃度為50 mmol/L的Zn2+，最后將所有樣品定容至5 mL，測(cè)量各樣品的紫外-可見(jiàn)-近紅外光譜。

1.2.4熒光傳感器在不同條件下的熒光強(qiáng)度取多份濃度為5 μmol/L的羅丹明B溶液1 mL，分別向其中加入濃度為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6 mL制備的80 nm Au-NSs，然后將各樣品定容至5 mL，檢測(cè)各樣品的熒光強(qiáng)度；取多份濃度為5 μmol/L的羅丹明B溶液1 mL，同時(shí)向所有樣品中加入2 mL制備的80 nm Au-NSs，然后分別向各樣品中加入不同濃度不同體積的Zn2+溶液，最后將所有樣品定容至5 mL，使各樣品中Zn2+濃度分別為0.2、2、20、50 μmol/L及0.2、0.5、1、2、5 mmol/L，測(cè)量各樣品的熒光強(qiáng)度。

1.2.5熒光傳感器檢測(cè)其他過(guò)渡金屬離子取多份濃度為5 μmol/L的羅丹明B溶液1 mL，同時(shí)向所有樣品中加入2 mL制備的80 nm Au-NSs，然后分別向各樣品中加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、2 mL濃度為50 mmol/L的Mn2+、Cu2+、Co2+、Ni2+，測(cè)量各樣品的熒光強(qiáng)度。

2 檢結(jié)果與討論

2.1 羅丹明B修飾金納米星后加入Zn2+過(guò)程中的UV-Vis-NIR光譜變化情況

如圖1所示，通過(guò)種子生長(zhǎng)法制備的Au-NSs最大吸收波長(zhǎng)在933 nm左右，吸光度為0.6529，其吸光系數(shù)為9.77×109mol/(L·cm)[22]，通過(guò)朗伯-比爾定律可計(jì)算出該Au-NSs摩爾濃度約為70 pmol/L。羅丹明B的水溶液最大吸收峰在554 nm附近，且在520 nm附近有一個(gè)較弱的吸收帶，主要是羅丹明B的二聚物引起的。將二者進(jìn)行混合，羅丹明B濃度均為1 μmol/L，隨著Au-NSs濃度的增大(圖1)，羅丹明B的特征峰向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，且峰的相對(duì)強(qiáng)度逐漸減弱，其原因可能是越來(lái)越多的羅丹明B與Au-NSs結(jié)合，Au-NSs的束縛使得羅丹明B的電子躍遷變得更難發(fā)生，這種束縛的作用力主要來(lái)自于羅丹明B中帶正電荷的氮原子與Au-NSs表面帶負(fù)電荷的抗壞血酸之間的靜電作用力。在濃度為28 pmol/L的Au-NSs 和1 μmol/L的羅丹明B混合液中加入不同濃度的Zn2+，結(jié)果顯示羅丹明B的特征峰值又逐漸增強(qiáng)，且增加量與Zn2+濃度呈正比，特征波長(zhǎng)出現(xiàn)少量的藍(lán)移逐漸回到554 nm附近，如圖2所示。這說(shuō)明Zn2+的存在會(huì)削弱羅丹明B和Au-NSs的相互作用。

2.2 利用熒光傳感器檢測(cè)Zn2+濃度

如圖3所示，羅丹明B在580 nm附近存在一個(gè)明顯的發(fā)射波長(zhǎng)。在濃度為1 μmol/L的羅丹明B中加入不同濃度的Au-NSs后，羅丹明B的熒光強(qiáng)度會(huì)顯著減弱。通過(guò)線性擬合，發(fā)現(xiàn)熒光猝滅的程度F0/F(y)與Au-NSs的濃度(x)呈良好的線性關(guān)系，線性擬合方程為：y=0.07x+0.9378，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9926。其中F0表示羅丹明B溶液的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)表示羅丹明B加入Au-NSs后的熒光強(qiáng)度。在此體系中Au-NSs 充當(dāng)猝滅劑，線性關(guān)系的成立說(shuō)明這種猝滅現(xiàn)象的機(jī)制為靜態(tài)猝滅。

圖1 Au-NSs(a)、羅丹明B(b)以及二者混合(c，d，e，f)的UV-Vis-NIR圖Fig.1 UV-Vis-NIR absorbance spectra of Au-NSs(a),Rhodamine B(b) and mixture of them(c - f)The concentrations of the added Au-NSs are c:14 pmol/L;d:28 pmol/L;e:42 pmol/L;f:56 pmol/L.

圖2 羅丹明B修飾Au-NSs后加入不同濃度Zn2+的UV-Vis-NIR圖Fig.2 UV-Vis-NIR absorbance spectra of Rhodamine B modified Au-NSs after adding different concentrations of Zn2+ a:0 mmol/L;b:0.2 mmol/L;c:0.5 mmol/L;d:1 mmol/L;e:5 mmol/L;f:20 mmol/L.

隨后將羅丹明B和Au-NSs二者混合，固定羅丹明B濃度為1 μmol/L和Au-NSs濃度為28 pmol/L不變，分別向其中加入不同濃度的Zn2+，發(fā)現(xiàn)羅丹明B的熒光強(qiáng)度明顯地恢復(fù)(圖4)，而且其熒光恢復(fù)率：(Fon-Foff)/F0(y)與Zn2+的濃度(x)呈良好線性關(guān)系，線性擬合方程為y=0.0811x+0.01158，R2=0.9950。其中F0表示羅丹明B水溶液的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)off表示羅丹明B修飾Au-NSs后的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)on表示在羅丹明B修飾Au-NSs后加入Zn2+的熒光強(qiáng)度。在本次實(shí)驗(yàn)條件下，Zn2+的最低檢測(cè)濃度可達(dá)到0.013 mg/L，線性范圍為0.2 μmol/L～5 mmol/L。

圖3 在羅丹明B中加入不同濃度的Au-NSs的熒光光譜圖Fig.3 Fluorescence pattern of Rhodamine B after adding different concentrations of Au-NSsa:0 pmol/L,b:5.6 pmol/L,c:11.2 pmol/L,d:16.8 pmol/L,e:22.4 pmol/L,f:28 pmol/L,g:33.6 pmol/L,h:39.2 pmol/L,i:44.8 pmol/L,j:50.4 pmol/L.(From top to bottom).

圖4 羅丹明B修飾Au-NSs后加入不同濃度Zn2+的熒光光譜圖Fig.4 Fluorescence pattern of Rhodamine B modified Au-NSs after adding different concentrations of Zn2+The top is 1μmol/L RhB(a) and the bottom is 1 μmol/L RhB+28 pmol/L Au-NSs(b),between them are 1 μmol/L RhB+28 pmol/L AuNSs+Zinc ions of different concentrations.c:0.2 μmol/L,d:2 μmol/L,e:20 μmol/L,f:50 μmol/L,g:0.2 mmol/L,h:0.5 mmol/L,i:1 mmol/L,j:2 mmol/L,k:5 mmol/L.

圖5 熒光恢復(fù)率與各種離子濃度的關(guān)系Fig.5 Relationship between fluorescence recovery rate and concentration of various ionsa:Mn2+;b:Cu2+;c:Co2+;d:Ni2+.

2.3 熒光傳感器的選擇性

為了觀察羅丹明B修飾的Au-NSs體系對(duì)其他離子是否也具有選擇性，在羅丹明B修飾的Au-NSs中加入了不同濃度的Mn2+、Cu2+、Co2+和Ni2+，觀察體系是否存在熒光恢復(fù)及其恢復(fù)程度的變化規(guī)律。從圖5可以看出，當(dāng)加入了一定量的其它金屬離子后羅丹明B的熒光強(qiáng)度均存在一定的恢復(fù)，但其熒光恢復(fù)率與加入的離子濃度均無(wú)良好的線性關(guān)系，且恢復(fù)效率不理想。這說(shuō)明羅丹明B修飾的Au-NSs對(duì)于Zn2+濃度的檢測(cè)具有一定的特異性，這可能與Zn2+最外層更緊密的電子排布有關(guān)，具體原因還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

Au-NSs會(huì)促使羅丹明B發(fā)生明顯的熒光猝滅，但是在Zn2+的存在下，其熒光強(qiáng)度逐漸恢復(fù)，且熒光恢復(fù)率與Zn2+濃度呈良好的線性關(guān)系。因此我們構(gòu)建了一種高效、方便快捷、操作簡(jiǎn)單的用于檢測(cè)Zn2+的熒光傳感器，具有一定的應(yīng)用潛力。