李天雪， 胡玉濤*， 韋 笑， 褚朝森

(1.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院連云港中醫(yī)藥分院，江蘇連云港 222007；2.連云港市藥物研發(fā)共性技術(shù)中心，江蘇連云港 222007)

加味四逆散由柴胡、白芍、枳實(shí)、甘草、黃芩、黃連和蒲公英組成，主治疏肝理氣，該驗(yàn)方應(yīng)用范圍廣泛，因其具有抑制抑郁和神經(jīng)保護(hù)等生物活性[1 - 4]，引起醫(yī)藥行業(yè)的關(guān)注。中藥復(fù)方的臨床藥理是多種有效成分協(xié)同作用的結(jié)果，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明四逆散及加味方中活性成分很多，目前檢測(cè)其活性成分的方法主要有高效液相色譜-紫外法(HPLC-UV)[5]、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法(HPLC-ELSD)[6]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[7 - 8]等。近年來(lái)，因精確性高、選擇性強(qiáng)，LC-MS法在醫(yī)藥化工領(lǐng)域已成為多成分微量分析的首選方法[9-11]，尤其是固相萃取(SPE)及超高效色譜(UPLC)分離技術(shù)的應(yīng)用，使得高通量生物樣品分析成為可能[12 - 13]。但關(guān)于加味四逆散中多生物活性成分體內(nèi)定量測(cè)定方法的研究尚少。

本實(shí)驗(yàn)建立了SPE法處理血漿樣品，UPLC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)加味四逆散中6種生物活性化合物的方法，定量限達(dá)2 ng/mL。方法為調(diào)整加味復(fù)方用藥劑量提供參考，對(duì)四逆散新藥開(kāi)發(fā)、臨床有效合理用藥具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑及材料

安捷倫1290 LC-6460三重四極桿QQQ串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有四元低壓梯度泵和MassHunter工作站(美國(guó)，安捷倫科技公司)；Eppendorf 5427 R低溫高速離心機(jī)(德國(guó)，Eppendorf有限公司)；Oasis?HLB固相萃取柱(規(guī)格60 mg，美國(guó)沃特世科技有限公司)。

柴胡皂苷a(批號(hào)：20170722)、芍藥苷(批號(hào)：20170425)、橙皮苷(批號(hào)：20170801)、橙皮素(批號(hào)：20170808)、甘草酸(批號(hào)：20170706)、甘草苷(批號(hào)：20170711)和內(nèi)標(biāo)物(IS)金雀異黃素(批號(hào)：20170508)，均由南通經(jīng)緯生物科技有限公司提供(≥99%)。混合對(duì)照品溶液：分別精密稱(chēng)取柴胡皂苷a、芍藥苷、橙皮苷、橙皮素、甘草酸和甘草苷各10 mg，單獨(dú)以甲醇溶解并定容，配成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液；分別精密量取適量?jī)?chǔ)備液于同一容量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，配制得系列混合對(duì)照品工作液，低溫避光保存。內(nèi)標(biāo)工作液：精密稱(chēng)取10 mg金雀異黃素對(duì)照品，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。臨用前將內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為6 μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。色譜純甲醇(Sigma公司)、色譜純乙腈(Merk公司)；其余試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。超純水經(jīng)過(guò)Milli-Q系統(tǒng)純化制備。

柴胡、白芍、枳實(shí)、甘草、黃芩、黃連和蒲公英藥材購(gòu)自同仁堂藥店(連云港)。

1.2 儀器條件

色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱(100×2.1 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液-乙腈，梯度洗脫：0～3 min，15%～25%乙腈；8～10 min，35%～50%乙腈；13～15 min，60%～80%乙腈；系統(tǒng)平衡3 min；體積流量0.5 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜采用電噴霧負(fù)離子源(ESI-)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)檢測(cè)；駐留時(shí)間為50 ms；檢測(cè)電壓為3.5 kV；離子源溫度為150 ℃；錐孔電壓為220 V；脫溶劑溫度為350 ℃；脫溶劑氣體(N2)體積流量為8 L/h。柴胡皂苷a、芍藥苷、橙皮苷、橙皮素、甘草酸和甘草苷的檢測(cè)離子的質(zhì)荷比和碰撞能量分別是：m/z779→439，64 eV；m/z525→121，25 eV；m/z609→301，22 eV；m/z301→164，18 eV；m/z821→351，42 eV；m/z417→255，21 eV。

1.3 提取液的制備

將中藥制成粗粉，按比例取以上中藥粗粉加8倍量水浸泡30 min，沸騰后文火加熱45 min后取汁，重復(fù)2次，合并2次所得藥液并過(guò)濾，藥液常溫冷卻后，置4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。為確定用藥劑量，外標(biāo)法檢測(cè)提取液中柴胡皂苷a、芍藥苷、橙皮苷、橙皮素、甘草酸和甘草苷的含量，分別為1.04、4.53、6.5、1.2、8.2和2.76 μg/mL。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

7只雄性SD大鼠(200±20 g)購(gòu)自浙江實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)7 d，維持溫度23～26 ℃，濕度55%±10%，實(shí)驗(yàn)前12 h停止進(jìn)食，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵守相關(guān)動(dòng)物管理準(zhǔn)則。用灌胃針給每只大鼠灌胃口服JWSNS提取液(10 mL/kg)，在0、0.167、0.33、0.5、0.75、1、1.5、3、8、12和24 h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行大鼠眼眶取血，約0.25 mL血液樣品收集在肝素鈉離心管中，室溫8 000 r/min離心10 min，制得血漿樣品。

1.5 血漿樣品處理

Oasis?HLB固相萃取柱活化：先加入1 mL甲醇沖洗，后加入1 mL超純水沖洗。取100 μL血漿樣品，置于1.5 mL無(wú)菌離心管中，加入10 μL 內(nèi)標(biāo)(6 μg/mL)，渦旋30 s混勻，取混合溶液裝載進(jìn)活化后的固相萃取柱，加入1 mL超純水沖洗小柱，后加入1.5 mL甲醇洗脫，取甲醇洗脫液于試管中，40 ℃氮?dú)獯蹈桑尤?00 μL 50%甲醇水溶液復(fù)溶，渦旋振蕩30 s，4 ℃低溫12 000 r/min離心5 min，取上清進(jìn)樣5 μL檢測(cè)分析。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品及質(zhì)控樣品的制備

標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品：分別精密量取上述系列混合對(duì)照品工作液適量，加入100 μL空白血漿中，制成6個(gè)濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，含芍藥苷、橙皮苷和柴胡皂苷a質(zhì)量濃度梯度為2、5、10、50、250、1 000 ng/mL；橙皮素、甘草酸和甘草苷濃度梯度均為2、5、25、100、500、1 500 ng/mL。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品中含內(nèi)標(biāo)60 ng。

質(zhì)控樣品：精密量取適量對(duì)照品工作液，置100 μL空白血漿中，制備成低、中、高3個(gè)濃度水平的質(zhì)控樣品，6種對(duì)照品的3個(gè)濃度均為5、100和1 000 ng/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1專(zhuān)屬性取6份不同來(lái)源的空白大鼠血漿，配制加入對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，取大鼠灌胃服藥后的血漿樣品，分別進(jìn)行分析以考察方法專(zhuān)屬性，記錄質(zhì)譜圖?？瞻讟悠泛秃幯獫{樣品的典型質(zhì)譜圖譜見(jiàn)圖1，6種化合物分離度合適，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)無(wú)干擾。

圖1 各化合物的空白和血漿樣品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖Fig.1 Typical MRM chromatograms of blank and a real sample,indicating specificity of the method

2.1.2線性關(guān)系和定量限取含內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，以血漿中分析物的濃度(x)為橫坐標(biāo)，分析物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸(權(quán)重因子為1/X2)。在信噪比(S/N)≥10，重復(fù)分析5次標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，其精密度(RSD)應(yīng)≤15%，準(zhǔn)確度的誤差在參考值±20%以內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品中的最低濃度為定量限[14]。結(jié)果表明，芍藥苷、橙皮苷和柴胡皂苷a在濃度2～1 000 ng/mL范圍內(nèi)，橙皮素、甘草酸和甘草苷在濃度2～1 500 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，各化合物的線性相關(guān)系數(shù)r2≥0.998。6種化合物的定量限均為2 ng/mL，該方法適合體內(nèi)微量成分定量分析。

2.1.3精密度和準(zhǔn)確度用空白大鼠血漿配制低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品各5份，連續(xù)測(cè)定3 d，用線性方程計(jì)算相應(yīng)的濃度，分別考察日內(nèi)和日間精密度與準(zhǔn)確度。結(jié)果表明，6種分析物的3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品的日內(nèi)和日間RSD均小于8.3%，準(zhǔn)確度為94.3%～104.9%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果

(續(xù)表1)

CompoundSample(ng/mL)Inter-dayIntra-dayRSD(%)Accuracy(%)RSD(%)Accuracy(%)Recovery(%)Matrix effect(%)Hesperidin54.597.46.199.288.591.21005.299.31.3100.194.395.21 0002.1102.22.295.185.9100.8Hesperetin54.2103.44.696.689.382.51001.7103.32.298.485.884.61 0003.894.34.4102.486.787.6GA53.697.83.7103.190.290.51002.095.84.296.894.196.41 0007.299.16.294.589.794.7Liquiritin55.595.68.397.492.397.21006.296.85.6102.589.498.21 0001.5104.22.299.690.292.1

2.1.4穩(wěn)定性分析血漿質(zhì)控樣品在不同的儲(chǔ)存條件下以考察穩(wěn)定性，分別考察樣品在室溫下儲(chǔ)存12 h的短期穩(wěn)定性、在4 ℃下放置在儀器自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)12 h的穩(wěn)定性、在-20 ℃下儲(chǔ)存14 d的長(zhǎng)期穩(wěn)定性、3次冷凍-解凍循環(huán)后(-20 ℃到20 ℃)的穩(wěn)定性，采用凍融樣品與新鮮制備的樣品對(duì)照獲得準(zhǔn)確度數(shù)據(jù)，結(jié)果見(jiàn)表2。準(zhǔn)確度誤差均符合要求(100%±15%)，結(jié)果表明各分析物的血漿樣品在上述儲(chǔ)存條件下性質(zhì)穩(wěn)定。

表2 不同條件下6種化合物穩(wěn)定性結(jié)果

2.1.5提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度平行制備5份，按前述固相萃取法處理后進(jìn)行分析，記錄色譜響應(yīng)峰面積為A?？瞻籽獫{處理后添加對(duì)照品工作液，制備質(zhì)控樣品同濃度的溶液，進(jìn)樣分析，記錄峰面積為B。同濃度的對(duì)照品工作液，不經(jīng)加血漿的生物處理直接分析記錄峰面積為C。內(nèi)源性物質(zhì)引起的基質(zhì)效應(yīng)表示為：B/C×100%，提取回收率為：A/B×100%。分析結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，橙皮素基質(zhì)效應(yīng)為82.5%～87.6%，其他化合物均在90.5%～101.6%，基質(zhì)效應(yīng)不明顯，所得數(shù)據(jù)良好。提取回收率在85.8%～94.3%之間，滿足生物樣品濃度測(cè)定的要求。

2.2 藥代動(dòng)力學(xué)研究

方法學(xué)考察后，該方法應(yīng)用于大鼠血漿中6種化合物的定量分析，血藥濃度曲線見(jiàn)圖2?？傮w而言，6種化合物都能很快吸收，在0.5 h前均能達(dá)到最大血藥濃度(cmax)。甘草酸的生物利用度均較低，因?yàn)榭诜?，它被腸道微生物轉(zhuǎn)化為其活性代謝物甘草次酸[15]，甘草苷也存在類(lèi)似現(xiàn)象。在藥材中，橙皮苷含量高于橙皮素，而橙皮苷AUc0～24h入血含量卻低于橙皮素，可能是橙皮苷上黃酮糖苷鍵被腸道微生物水解生成橙皮素。24 h時(shí)橙皮素的含量仍高于定量限，而其它化合物已無(wú)法定量，可能是肝腸循環(huán)作用減緩了橙皮素清除速率。和其它文獻(xiàn)相比，各化合物的藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果有所不同[7 - 8,11]，可能是藥材間協(xié)同作用和藥材產(chǎn)地不同的原因。

圖2 口服給藥加味四逆散提取液后6種化合物的血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.2 Mean plasma concentration-time profile of the six compounds after oral administration of Jia-Wei-Si-Ni-San

2.3 色譜及質(zhì)譜條件的選擇

預(yù)實(shí)驗(yàn)中，為優(yōu)化樣品處理方法，考察比較了液液萃取法、固相萃取法、蛋白沉淀法三種方法的提取效率。液液萃取法選擇性好，但提取率的重復(fù)性差；蛋白沉淀法處理血漿樣品簡(jiǎn)單快速，但基質(zhì)效應(yīng)明顯；固相萃取法的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果都較高。綜上考慮，本試驗(yàn)選擇固相萃取法對(duì)血漿樣品進(jìn)行處理。根據(jù)分析物的理化性質(zhì)和色譜特征，比較了以甲醇、乙腈和水、甲酸-水、乙酸-水構(gòu)成的液相系統(tǒng)，結(jié)果表明，以甲醇-水或酸水為系統(tǒng)各成分的分離效果不理想，乙腈-乙酸水系統(tǒng)色譜峰的對(duì)稱(chēng)性不好，經(jīng)優(yōu)化后的乙腈-甲酸水系統(tǒng)各成分的分離效果較好，基線平穩(wěn)。另外，本文選擇梯度洗脫條件，可改變被分析物的保留時(shí)間，從而使得被分析與共流出物分離減小基質(zhì)效應(yīng)。內(nèi)標(biāo)在生物樣品定量分析中用來(lái)修正提取過(guò)程中損耗，因此，應(yīng)該選擇提取回收效果及質(zhì)譜離子響應(yīng)和被分析物相似的化合物，金雀異黃素的極性、質(zhì)譜分析條件和離子響應(yīng)程度均有較好表現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)選擇它為內(nèi)標(biāo)物，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，方法學(xué)考察中，它的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)(n=5)分別為91.4%±6.8%和90.2%～96.3%。

3 結(jié)論

本文建立了高靈敏度、快速及高通量的6種有效物質(zhì)血漿濃度的測(cè)定方法，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，通過(guò)對(duì)加味四逆散在大鼠體內(nèi)進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究，為新藥開(kāi)發(fā)及臨床安全用藥提供了參考依據(jù)。