劉芳超， 董朝青， 任吉存

(上海交通大學化學化工學院，上海 200240)

金納米粒子(Gold Nanoparticles,AuNPs)由于具有強的表面等離子體共振等光學性質、穩(wěn)定的物理化學性質、易于化學合成和表面修飾以及生物相容性好等優(yōu)點，目前在生物傳感[1 - 4]、基因或藥物輸送[5]、光動力學治療[6]等領域具有重要的應用。AuNPs在這些生物應用過程中，如何準確測定其濃度是十分重要的。目前已經(jīng)發(fā)展了多種AuNPs濃度的測定方法，如原子光譜/質譜-透射電鏡測定法[7 - 8]、紫外-可見分光光度法[9]、流式細胞術計數(shù)法[10]、成像計數(shù)方法[11 - 12]、共振光散射相關光譜法[13]等。原子光譜/質譜-透射電鏡測定法包括原子吸收光譜法、原子發(fā)射光譜法和質譜法等，是AuNPs濃度測定的經(jīng)典方法。這類方法首先通過透射電鏡測定AuNPs尺寸從而估計它所含Au原子數(shù)，同時將AuNPs消解后用原子光譜/質譜方法測定Au的濃度，從而計算AuNPs濃度。該方法測量結果準確，但步驟多，耗時長，其準確度受限于透射電鏡法測定AuNPs中Au原子數(shù)，如AuNPs形貌的不規(guī)則等。紫外-可見光譜法是目前最簡便的測定方法。在測定過程中采用其共振吸收峰處的吸光度值和相應的摩爾吸光系數(shù)值來計算。摩爾吸光系數(shù)值一般采用原子光譜/質譜-透射電鏡測定法測得的數(shù)據(jù)，目前已有一些共振吸收峰波長與摩爾吸光系數(shù)值對應表[9]。但是，由于AuNPs的共振吸收峰位置隨其尺寸變化的響應靈敏度較低，并易受表面配體的影響，這些都直接影響了該方法的準確應用。

近年來，Yan等人基于AuNPs在鞘流中形成的高信背比光子爆發(fā)信號，建立了流式細胞術測定AuNPs濃度的方法[10]；Long等人建立了AuNPs成像計數(shù)分析方法[11]；Ren等人建立了一種共振光散射相關光譜方法，實現(xiàn)了AuNPs濃度的測定[13]。這些方法主要利用了AuNPs的強共振散射光性質，對納米顆粒進行直接測定。由于AuNPs在普通光源照射下激發(fā)產生的熒光很弱，甚少利用其熒光進行AuNPs的定量分析和成像分析。Ren等人發(fā)現(xiàn)，在激光照射下AuNPs能發(fā)出足夠強的熒光信號，可被單光子檢測器檢測到信號，實現(xiàn)單顆粒分析[14]。

本文采用常見的檸檬酸三鈉還原氯金酸的方法合成了多種不同粒徑的AuNPs，利用激光激發(fā)AuNPs產生熒光信號，以實驗室自主構建的熒光相關光譜(Fluorescence Correlation Spectroscopy，F(xiàn)CS)系統(tǒng)為檢測儀器，通過優(yōu)化光強等因素，建立了溶液中AuNPs摩爾濃度的直接測定方法，并與紫外-可見光譜法測得的濃度進行了比較。結果表明，建立的方法快速簡便，可實現(xiàn)溶液中AuNPs摩爾濃度的直接測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

FCS系統(tǒng)[15]是在一臺IX71倒置顯微鏡(日本，Olympus)基礎上構建而成的，該系統(tǒng)使用561 nm的激光(德國，Coherent)作為激發(fā)光源。激光經(jīng)過擴束鏡擴束后由570DRLP雙色鏡(美國，Omega Optical)反射進入60×/NA1.2顯微鏡物鏡(日本，Olympus)，經(jīng)物鏡聚焦后激光照射到蓋玻片上的樣品溶液中。樣品激發(fā)產生的熒光信號，經(jīng)顯微鏡物鏡收集后，透過雙色鏡和兩片發(fā)射濾光片605DF50 和 BA590(美國，Omega Optical)濾除雜散光。通過的熒光經(jīng)過35 μm針孔后由SPCM-AQR14單光子計數(shù)器(加拿大，Perkin-Elmer EG & G)收集。采集到的信號由Flex02-12D/C數(shù)字相關卡(深圳，Correlator.com)記錄并自相關計算，得到FCS曲線。UV-3501紫外-可見分光光度計和WGY-10熒光光度計(天津市港東科技發(fā)展有限公司)；JEM-2100透射電子顯微鏡(日本，電子)。

HAuCl4和檸檬酸三鈉均購自國藥集團化學試劑有限公司；葉酸、巰基聚乙二醇(分子量：5 000)、羅丹明 B (RB)購自美國Sigma-Aldrich公司。實驗用水為超純水。

1.2 AuNPs的合成及修飾

AuNPs采用經(jīng)典的檸檬酸三鈉還原HAuCl4的方法[15]制備。即油浴加熱下在圓底燒瓶中加入98 mL超純水和121 μL 0.2 mol/L HAuCl4，充分攪拌。待溶液沸騰后加入適量體積的0.01 g/mL 檸檬酸三鈉溶液。反應溶液逐漸由黃色變?yōu)闊o色，再變成黑色，最終變成酒紅色，之后繼續(xù)加熱15 min。將溶液冷卻至室溫，保存待用。通過改變加入檸檬酸三鈉的體積，可以合成出不同尺寸的AuNPs。

表面修飾：將合成的1 mL AuNPs溶液，于4 000 r/min離心20 min后，棄去上清液；向其中加入10 μL 5 mmol/L的葉酸或者巰基聚乙二醇，混勻后室溫下反應6 h，待用。

1.3 紫外-可見光譜法測定AuNPs濃度

先采用透射電鏡測得AuNPs的平均粒徑，然后根據(jù)文獻查出其在共振吸收峰的摩爾吸光系數(shù),再由紫外-可見分光光度計測定其在共振吸收峰的吸光度計算其濃度[9]。

1.4 熒光相關光譜法測定AuNPs濃度

測定前選用8 nmol/L羅丹明B為標準品對儀器系統(tǒng)進行校正，并測定熒光相關光譜系統(tǒng)的檢測微區(qū)的體積。然后取用60 μL的AuNPs溶液或者修飾產物滴加在蓋玻片上進行FCS測定，每次采樣時間為120 s，平行測定3次。

2 結果與討論

2.1 測定原理

熒光相關光譜中，激光通過聚焦物鏡形成一個橢球形檢測微區(qū)。溶液中AuNPs由于布朗運動不斷進出該檢測微區(qū)，從而在單光子計數(shù)器中生成熒光漲落信號，經(jīng)數(shù)字相關卡對這些漲落信號進行自相關函數(shù)分析后，得到自相關曲線。根據(jù)分子/粒子自由擴散的自相關函數(shù)模型(公式1)，曲線在縱軸上的截距(當τ=0時G(0))為檢測微區(qū)內粒子數(shù)N的倒數(shù)值。

(1)

公式中，N為檢測微區(qū)內平均分子或粒子數(shù)，τD為熒光分子或粒子的特征擴散時間，ω0和z0分別為橢圓形檢測微區(qū)的軸向半徑和縱向半徑[17]。

檢測微區(qū)體積的測定：采用已知擴散系數(shù)D的RB為標準品(溫度在25 ℃下水溶液中的擴散系數(shù)約為2.8×10-6cm2/s)測定其FCS曲線，然后采用Origin 8.0 軟件以公式1對獲得的FCS曲線進行非線性最小二乘擬合，得到τD和S值，再采用公式(2)計算出檢測微區(qū)體積。

(2)

其中，Veff為有效檢測體積，S為檢測體積的構型參數(shù)(S=z0/ω0)，D為RB的擴散系數(shù)，τD為RB的特征擴散時間。

實驗測得檢測微區(qū)體積小于1.0 fL。因此在控制樣品溶液不揮發(fā)的情況下，可以實現(xiàn)微小體積的樣品檢測，樣品和試劑用量少。公式(3)為采用熒光相關光譜法測定濃度時的計算公式，其中NA為阿伏伽德羅常數(shù)。

(3)

2.2 AuNPs的表征

分別采用紫外-可見吸收光譜、熒光光譜和透射電鏡對合成不同尺寸的AuNPs進行了表征。這些粒子的粒徑分別為17.7 nm、 27.1 nm、37.8 nm和50.1 nm；共振吸收峰在520～530 nm之間；在630 nm處有熒光發(fā)射峰，可用于熒光檢測。其中37.8 nm的AuNPs的透射電鏡(TEM)圖、紫外-可見光吸收光譜和熒光光譜如圖1所示。

圖1 AuNPs透射電鏡(TEM)圖(A)(標尺為100 nm)、紫外-可見(UV-Vis)吸收光譜(B)和熒光光譜(C)Fig.1 TEM image (A) (Scale bar is 100 nm),UV-Vis absorption spectrum (B) and fluoreescence spectrum(C) of AuNPs

圖2 (A)在不同激光強度下測得的單顆粒熒光強度(BPP)柱狀比較圖；(B)在3.1 mW激發(fā)光強下測得的不同濃度AuNPs的熒光相關光譜(FCS)、擬合曲線、擬合殘差分布曲線(內插圖為測得AuNPs數(shù)目與濃度的線性關系曲線)Fig.2 (A) The histogram of brightness per particles(BPP) of AuNPs under different laser intensities;(B) The raw FCS,fitting,and residual curves of different concentration AuNPs under 3.1 mW of laser intensity(The inset is the linear relationship between the number and concentration)

2.3 檢測條件優(yōu)化

2.3.1激光光強對測定的影響AuNPs的熒光量子產率一般很低，在常規(guī)用于激發(fā)熒光小分子的激光光強(小于100 μW)下，其獲得的微弱熒光信號無法用于熒光相關光譜單顆粒分析。圖2A為激光強度分別為1.0 mW、3.1 mW、5.1 mW時AuNPs的單顆粒熒光強度；單顆粒熒光亮度隨著激光強度增加而增強。這些單顆粒熒光亮度已足以用于單顆粒分析實驗；同時，隨著激光增強，背景噪音信號也逐步增加，將影響熒光相關光譜分析。因此系統(tǒng)研究了激光光強對金納米粒子的熒光相關光譜曲線和濃度測定的影響。圖2B為不同濃度的37.8 nm AuNPs在3.1 mW激光強度下的熒光相關光譜曲線。研究發(fā)現(xiàn)，采用三維自由擴散模型(公式1)擬合原始熒光相關光譜曲線得到的相關系數(shù)R2在0.914～0.998之間，殘差介于±0.8之間，這說明AuNPs的三維自由擴散模型(公式1)可以很好地擬合熒光相關光譜曲線，并表明了粒子在水溶液中呈現(xiàn)布朗運動；另一方面，隨著納米粒子濃度的逐步減小，曲線的G(0)逐步增加(N值逐漸減小)，證明獲得的熒光相關光譜曲線確為AuNPs產生信號。內插圖顯示，測得的粒子數(shù)N與濃度具有良好的線性關系(相關系數(shù)為0.992)，說明熒光相關光譜方法可以用于納米粒子濃度的測定研究。

圖3為不同激光激發(fā)強度下測得的濃度與紫外-可見光吸收光譜法測得濃度(c0)關系曲線。在三種不同的光強下，線性擬合的相關系數(shù)R2分別為0.988、0.996、0.993，線性相關性均較好，斜率分別為1.22、0.82和0.84。光強為3.1 mW和5.1 mW時，線性相關系數(shù)和斜率均較接近。但在1.0 mW和5.1 mW時每個數(shù)據(jù)點的標準偏差較大。因此選定優(yōu)化后的激發(fā)光強為3.1 mW。

圖3 不同激光激發(fā)強度下熒光相關光譜(FCS)法測得濃度與紫外-可見(UV-Vis)光譜法測得濃度(c0)關系曲線 Fig.3 The correlation of concentrations determined with FCS and UV-Vis methods A:1.0 mW;B:3.1 mW;C:5.1 mW.

圖4 G(0)值隨采樣時間變化關系曲線Fig.4 The relationship between G(0) and the sampling time

2.3.2采樣時間對測定的影響熒光相關光譜法測定AuNPs的重現(xiàn)性與檢測時間有關，對檢測時間進行了優(yōu)化，如圖4所示。圖中誤差棒為三次平行測定的標準偏差。隨著采樣時間延長，G(0)值波動逐漸減小，G(0)值的標準偏差逐步變小；采樣時間超過60 s后，G(0)值基本不變；采樣時間超過120 s后，標準偏差顯著減小。因此，優(yōu)化后的采樣時間設置為120 s。

2.4 線性關系與檢測限

在最優(yōu)的檢測條件下測定不同濃度AuNPs溶液，以測得的粒子數(shù)N為縱坐標，摩爾濃度為橫坐標，得到它們的線性回歸方程。17.7 nm：N=0.079+0.331c，線性范圍為1～10 nmol/L，檢測限為0.82 nmol/L。27.1 nm：N=0.095+0.090c，線性范圍為0.2～7.9 nmol/L，檢測限為0.17 nmol/L。37.8 nm：N=0.014+0.125c，線性范圍為0.2～5.2 nmol/L，檢測限為0.13 nmol/L。50.1 nm：N=0.003+0.283c，線性范圍為0.2～1.2 nmol/L，檢測限為0.10 nmol/L。

2.5 實際樣品的測定

采用建立的分析方法對合成的不同尺寸、不同粒徑的一系列AuNPs樣品、巰基聚乙二醇和葉酸修飾的AuNPs樣品進行了測定，并與紫外-可見光譜法進行對比，結果見表1。結果表明，27.1 nm和37.8 nm AuNPs樣品測定中測定結果與紫外-可見光分光光度法結果接近。17.7 nm和50.1 nm AuNPs樣品測定結果與紫外-可見光分光光度法結果偏差較大。但測量過程顯示，熒光相關光譜測定過程中G(0)的變化仍與樣品稀釋倍數(shù)具有非常好的線性關系，因此這種偏差不應是樣品的背景噪音造成的，可能與紫外-可見光分光光度法測定時引用的摩爾吸光系數(shù)數(shù)據(jù)偏差有關。說明該方法可以用于不同粒徑、較寬的濃度范圍內AuNPs濃度的準確測定。

表1 熒光相關光譜(FCS)和紫外-可見(UV-Vis)光譜法測定不同粒徑AuNPs濃度的對比

aPEG -SH modified AuNPs;bFA modified AuNPs.

3 結論

利用AuNPs的熒光特性，采用熒光相關光譜建立了AuNPs摩爾濃度的測定方法，并成功用于合成的AuNPs溶液濃度測定。該方法在原理上與常用的原子光譜/質譜-透射電鏡測定法、紫外-可見分光光度法和近年來提出的流式細胞術計數(shù)法、成像計數(shù)方法有顯著不同。該方法快速簡便，樣品用量少，并對測定的樣品無破壞，有望應用于活細胞內AuNPs濃度的實時原位測定。