蔣大秀，馬 靜，王曉泉,2，胡順林,2，劉曉文,2*，劉秀梵,2

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；2.江蘇省重點(diǎn)動(dòng)物傳染病和人畜共患病預(yù)防控制聯(lián)合創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

1994年H9N2亞型AIV在我國(guó)廣東地區(qū)首次分離到，隨后在我國(guó)大部分地區(qū)家禽群體中廣泛流行[1]。H9N2 AIV單獨(dú)感染雞引起輕微的呼吸道癥狀，可以排毒，很少引起死亡，當(dāng)與其他病毒(如新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒等)發(fā)生混合感染，會(huì)導(dǎo)致呼吸道癥狀加重，死亡率上升[2]。水禽通常是自然攜帶，不發(fā)病，可以自然攜帶多種亞型禽流感病毒，成為AIV的儲(chǔ)存宿主。在中國(guó)，活禽市場(chǎng)是家禽零售的重要場(chǎng)所，不同來源的家禽聚集在一起，再以批發(fā)或者零售的方式銷售到城市的各個(gè)角落。因此，活禽市場(chǎng)成為不同來源家禽共同存在的場(chǎng)所，有研究表明病毒可以在活禽市場(chǎng)持續(xù)存在，不斷感染進(jìn)入市場(chǎng)的家禽，同時(shí)極有可能發(fā)生基因重組，形成新的流行株[3-4]，特別是H9N2、H6N6之類的低致病性AIV。在中國(guó)流行的H9N2 AIV主要分為G1-like和Y280-like，其八個(gè)基因片段的組成也不斷發(fā)生變化，目前流行的優(yōu)勢(shì)基因型是S基因型或G57基因型[5]。近年來，有文獻(xiàn)報(bào)道S基因型H9N2亞型AIV可以為H7N9[6-8]、H5N2[9-11]、H10N8[12]等亞型AIV提供內(nèi)部基因，并可以跨種間傳播感染人類，給公共衛(wèi)生帶來巨大威脅。因此，對(duì)活禽市場(chǎng)H9N2 AIV的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，尤其是對(duì)鵝、鴨等水禽來源的H9N2 AIV的監(jiān)測(cè)工作不容忽視[13]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

樣本處理液為含有抗生素的pH7.0～7.4的甘油-磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)；H1、H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10、H11亞型血清及新城疫病毒陽性血清、1%雞紅細(xì)胞均由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室制備并提供。無特定病原體(specific pathogen free, SPF)雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。RNA提取試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。PCR引物及測(cè)序由金斯瑞生物科技有限公司合成和完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集與病毒分離 2016年10月至2017年9月期間，定期每月于華東地區(qū)某活禽市場(chǎng)采集活禽的喉頭棉拭子和泄殖腔棉拭子樣品(合成1管，記作1份)，將采集的樣品尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，擴(kuò)增病毒。對(duì)于雞胚尿囊液無效價(jià)的樣品，要用雞胚盲傳三次。通過血凝-血凝抑制試驗(yàn)(HA-HI)分離、篩選出H9N2 AIV陽性樣品。

1.2.2 病毒RNA提取及RT-PCR 根據(jù)北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的RNA提取試劑盒及提供的說明書提取分離病毒RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)各個(gè)片段參考序列設(shè)計(jì)引物(詳見表1)，并根據(jù)引物Tm值設(shè)計(jì)PCR程序。經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，切取陽性條帶膠塊，進(jìn)行膠回收，將膠回收產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

表1 RT-PCR擴(kuò)增H9N2禽流感病毒各個(gè)基因片段的引物序列

1.2.3 序列編輯和比對(duì)分析 應(yīng)用DNASTAR、DNAMAN等軟件編輯、分析序列，從NCBI和GISAID數(shù)據(jù)庫(kù)下載H9N2 AIV標(biāo)準(zhǔn)參考株[14](序號(hào)1～7)和近年來本實(shí)驗(yàn)室分離株(序號(hào)8～14)(詳見表2)，運(yùn)用MEG6.0構(gòu)建各個(gè)基因片段的系統(tǒng)發(fā)生樹。

表2 H9N2 AIV參考毒株背景資料

2 結(jié) 果

2.1 H9N2病毒分離與鑒定

2016年10月至2017年9月，共計(jì)采樣12次，采集127個(gè)禽群、1 178份樣品，分離毒株由多至少依次為H9、H5、H7、H3、NDV、H6、H4、H11、H1、H10，H9亞型AIV分離率最高，多達(dá)100個(gè)分離株(詳見圖1)；H9N2亞型AIV在不同宿主中的分離率差別較大，雞源H9分離株93株，鵝源H9分離株5株，鴨源H9分離株2株；本研究對(duì)7株分離自水禽的H9N2亞型AIV展開研究，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，確定7個(gè)分離株均為H9N2病毒(病毒背景信息詳見表3)。

2.2 遺傳進(jìn)化分析

對(duì)7個(gè)H9N2病毒分離株各基因核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，并利用鄰接法(Neighbor-Joining method)繪制各個(gè)基因的系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果顯示不同基因片段遺傳發(fā)生存在不同的進(jìn)化趨勢(shì)。

2.2.1 血凝素(hemagglutinin， HA) 測(cè)序表明7株H9N2 AIV的HA基因編碼區(qū)均為1 683 bp，為完整的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，無核苷酸的插入。HA基因裂解位點(diǎn)(即由基因推導(dǎo)出的氨基酸序列第335—338位)均為RSSR，是典型的低致病性禽流感病毒特征性序列[14]。HA基因核苷酸相似性為98.2%～100.0%，推導(dǎo)出的氨基酸相似性為98.0%～100.0%。系統(tǒng)發(fā)生樹(圖2)顯示，分離株與參考株Y280/97處于同一個(gè)大分支，均屬于Y280-Like，核苷酸相似性為95.0%～96.0%，氨基酸相似性為91.0%～91.7%。比較近幾年的分離株的HA基因，發(fā)現(xiàn)本研究的7個(gè)分離株進(jìn)化趨勢(shì)具有較高的一致性，均屬于Group A，與SQ1602(2016)遺傳距離較近，核苷酸酸相似性為97.8%～98.6%，氨基酸相似性為97.3%～98.0%。

2.2.2 神經(jīng)氨酸酶(NA) 測(cè)序表明7株H9N2 AIV的NA基因編碼區(qū)均為1 401 bp，為完整的ORF，無核苷酸插入。NA基因相似性為96.2%～100.0%，推導(dǎo)出的氨基酸相似性為94.7%～100.0%。由系統(tǒng)發(fā)生樹(圖2)可見，分離株與參考株BJ/94雖然不在同一個(gè)分支，但是遺傳距離最近，故可以劃歸為BJ94-Like，與BJ/94的核苷酸相似性為93.4%～94.6%、氨基酸相似性為90.3%～91.0%，分離株核苷酸和氨基酸均發(fā)生了較大程度的變異。比較近幾年的分離株NA基因，該基因有分化趨勢(shì)，而本研究的7個(gè)分離株進(jìn)化趨勢(shì)具有一定的一致性。7個(gè)分離株與往年的分離株分屬于BJ94-Like的兩個(gè)Group，7個(gè)分離株均屬于Group A，除JS21之外的其他6個(gè)分離株與SQ1602(2016)遺傳距離較近，核苷酸相似性為97.1%～98.3%，氨基酸相似性為96.9%～97.6%；JS21與AH329(2016)遺傳距離較近，核苷酸相似性為99.8%，氨基酸相似性為99.6%。

圖1 不同月份采樣量及H9亞型AIV分離情況Fig.1 Sampling amount at different month and isolation of H9 subtype AIV

表3 活禽交易市場(chǎng)7株水禽源H9N2 AIV分離株的背景資料

標(biāo)注“a”與“b”分離自同一個(gè)鵝群

Strains marked with“a” “b” were isolated from the same goose flock

2.2.3 堿性聚合酶2 (polymerase basic protein 2, PB2) 測(cè)序表明7株H9N2 AIV的PB2基因編碼區(qū)均為2 280 bp，為完整的ORF。PB2基因核苷酸相似性為99.1%～100.0%，推導(dǎo)出的氨基酸相似性為99.1%～99.9%，進(jìn)化趨勢(shì)具有較高的一致性。由系統(tǒng)發(fā)生樹(圖3A)可見,分離株與參考株G1/97處于同一個(gè)大分支，均屬于G1-Like，核苷酸相似性為95.6%～96.3%，氨基酸相似性為95.4%～96.1%。

▲.H9N2 AIV分離株；●.參考株▲. H9N2 AIV isolate; ●. Reference virus圖2 7株分離株的HA、NA基因與參考序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic relationship of HA and NA gene of seven isolates with reference sequence

比較近幾年分離株的PB2基因，本研究的7個(gè)分離株進(jìn)化趨勢(shì)具有較高的一致性。分離株P(guān)B2基因與屬于G1-Like其他參考株屬于同一分支，但是明顯不屬于同一個(gè)Group，大致上可分為2個(gè)Group。分離株遺傳距離與GD1601(2016)較近，均屬于Group A，核苷酸及氨基酸相似性為98.4%～98.8%、98.1%～98.8%。

2.2.4 堿性聚合酶1 (polymerase basic protein 1, PB1) 測(cè)序表明7株H9N2 AIV的PB1基因編碼區(qū)均為2 274 bp，為完整的ORF。PB1基因核苷酸相似性為98.0%～100.0%，推導(dǎo)出的氨基酸相似性為97.7～100.0%。由系統(tǒng)發(fā)生樹(圖3B)可見，分離株與參考株F98/98處于同一個(gè)大分支，均屬于F98-Like，核苷酸相似性為97.3%～98.0%，氨基酸相似性為97.6%～98.4%。比較近幾年分離株的PB1基因，可大致上分為兩個(gè)Group，本研究的7個(gè)分離株進(jìn)化趨勢(shì)具有較高的一致性，與AH329(2016)均屬于Group A，核苷酸及氨基酸相似性為98.4%～99.3%、97.7%～99.2%。

2.2.5 酸性聚合酶蛋白(polymerase acidic protein, PA) 測(cè)序表明7株H9N2 AIV的PA基因編碼區(qū)均為2 151 bp，為完整的ORF。PA基因核苷酸相似性為99.3%～100.0%，推導(dǎo)出的氨基酸相似性為99.4%～100.0%，進(jìn)化趨勢(shì)具有較高的一致性。由系統(tǒng)發(fā)生樹(圖3C)可見，分離株與參考株F98/98處于同一個(gè)分支，均屬于F98-Like，核苷酸相似性為98.6%～99.0%，氨基酸相似性為98.6%～99.0%。比較近幾年分離株的PA基因，可大致上分為兩個(gè)Group，有兩個(gè)分化趨勢(shì)，分離株HuB92、HeN07和HeN10位于Group A，與AH329(2016)遺傳距離較近，核苷酸及氨基酸相似性為99.3%～99.9%、99.0%～99.4%；分離株LN34、JS72、JS21和JS53位于Group B，與TM38(2013)遺傳距離較近，核苷酸及氨基酸相似性為98.4%～98.7%、99.0%～99.2%。

2.2.6 核蛋白(NP) 測(cè)序表明7株H9N2 AIV的NP基因編碼區(qū)均為1 497 bp，無核苷酸插入，為完整的ORF。NP基因核苷酸相似性為97.8%～100.0%，氨基酸相似性為98.2%～100.0%，進(jìn)化趨勢(shì)具有較高的一致性。由系統(tǒng)發(fā)生樹(圖3D)可見，分離株與參考株F98/98遺傳距離最近，歸為F98-Like，核苷酸相似性為96.9%～98.2%，氨基酸相似性為98.0%～98.6%。比較近幾年分離株的NP基因，可大致上分為兩個(gè)Group，有兩個(gè)分化趨勢(shì)，分離株LN34、JS72、HeN07和HeN10位于Group A，與SQ1602(2016)遺傳距離較近，核苷酸及氨基酸相似性為98.0%～100.0%、98.6%～99.8%；分離株HuB92、JS21和JS53位于Group B，與AH329(2016)遺傳距離較近，核苷酸及氨基酸相似性為98.0%～99.8%、98.8%～99.0%。

2.2.7 基質(zhì)蛋白(matrix protein, M) 測(cè)序表明7株H9N2 AIV的M基因編碼區(qū)均為982 bp，可分為兩個(gè)ORF。M基因核苷酸相似性為99.1%～100.0%，氨基酸相似性為99.1%～100.0%，進(jìn)化趨勢(shì)具有較高的一致性。由系統(tǒng)發(fā)生樹(圖3E)可見，分離株屬于同一分支，與參考株G1/97遺傳距離最近，均歸為G1-Like，核苷酸相似性為94.6%～95.2%，氨基酸相似性為92.9%～93.6%，同源性較低。比較近幾年分離株的M基因，可大致上分為兩個(gè)Group，本研究的7個(gè)分離株與AH329(2016)均屬于Group A，遺傳距離較近，核苷酸及氨基酸相似性為98.8%～99.4%、98.4%～99.1%。

2.2.8 非結(jié)構(gòu)蛋白(Nonstructural protein, NS) 測(cè)序表明7株H9N2 AIV的NS基因編碼區(qū)均為838 bp，均為完整的ORF，可編碼2種蛋白。NS基因核苷酸相似性為96.7%～100.0%，氨基酸相似性為96.3%～100.0%，進(jìn)化趨勢(shì)具有較高的一致性。由系統(tǒng)發(fā)生樹(圖3F)可見，分離株NS基因與參考株F98/98同屬于一個(gè)大的分支，歸為F98-Like，大致上可分為2個(gè)Group，核苷酸相似性為94.0%～94.4%，氨基酸相似性為91.2%～93.9%，同源性較低。比較近幾年分離株的NS基因，可大致上分為兩個(gè)Group，本研究的7個(gè)分離株均屬于Group A。屬于Group A分離株JS21并未與其他6個(gè)分離株聚類在一起。分離株與TM38(2013)同源性較高，核苷酸及氨基酸相似性為97.8%～99.3%、97.4%～99.3%。

3 討 論

H9N2亞型禽流感作為一種低致病性禽流感，在我國(guó)流行范圍較廣，四季均可發(fā)生，無明顯的季節(jié)性，尤以秋冬季節(jié)病毒分離率較高(詳見圖1)，這可能與AIV喜寒惡熱的生物學(xué)特性有關(guān)。由H9N2 AIV分離數(shù)據(jù)分析，一方面，該亞型的分離率是各亞型中最高的；另一方面，該亞型在水禽(主要是鴨、鵝)中的分離率要明顯低于陸生禽(主要是雞)。有報(bào)道稱，雞是H9N2 AIV的易感宿主，鴨、鵝等水禽是該病毒的天然儲(chǔ)存宿主[1]，所以對(duì)水禽來源的H9N2 AIV進(jìn)行持續(xù)的流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)于防控正在流行的H9N2 AIV優(yōu)勢(shì)株或即將流行的H9N2 AIV潛在優(yōu)勢(shì)株是有一定意義的。

對(duì)2016年10月至2017年9月分離到的5個(gè)鵝源H9N2 AIV分離株、2個(gè)鴨源H9N2 AIV分離株各個(gè)基因片段序列進(jìn)行編輯處理后，結(jié)合F98等H9亞型經(jīng)典參考株及本實(shí)驗(yàn)室近年來上傳于GISAID數(shù)據(jù)庫(kù)中的H9亞型毒株序列(詳見表2)繪制出各基因片段系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果表明7個(gè)分離株均屬于當(dāng)今流行的H9N2 AIV基因型——S基因型[5]。總體上，對(duì)系統(tǒng)發(fā)生樹進(jìn)行分析，分離株各個(gè)基因片段遺傳進(jìn)化均存在一定的差異，其中4個(gè)基因(HA、PB2、PB1和M)遺傳進(jìn)化較為一致。分離株的HA基因遺傳進(jìn)化趨勢(shì)一致，與SQ1602(2016)同源性較高，分離株中除了JS21的NA基因與AH329(2016)同源性較高外，均與SQ1602(2016)同源性較高，分離株的HA基因和NA基因可能有著類似的基因來源和遺傳進(jìn)化趨勢(shì)；PB1基因和M基因遺傳進(jìn)化趨勢(shì)一致，均與AH329(2016)同源性較高，PB1基因和M基因可能有著類似的基因來源和遺傳進(jìn)化趨勢(shì)；PB2基因遺傳進(jìn)化趨勢(shì)一致，與GD1601(2016)同源性較高；NS基因同處于Group A，與TM38(2013)同源性較高，但分離株JS21與其他六株病毒遺傳距離較遠(yuǎn)；PA基因和NP基因均處于不同的Group，可能有著不同的基因來源和遺傳進(jìn)化趨勢(shì)。綜合分析結(jié)果，分離株LN34和JS72均在2016年12月份分離，宿主來自不同地區(qū)，在活禽市場(chǎng)也是分布在不同的禽群，但是兩個(gè)毒株的基因片段同源性極高，進(jìn)化趨勢(shì)幾乎一致，病毒極有可能是持續(xù)存在于活禽市場(chǎng)的病毒，造成進(jìn)入市場(chǎng)交易的家禽感染；分離株HeN07和HeN10都是在2016年11月的同一個(gè)鵝群分離到，但是其NS基因在發(fā)生樹上(圖3F)并不聚類在一起，說明病毒還可能存在重組的現(xiàn)象；分離株JS21的NA基因和NS基因均不與其他六個(gè)分離株聚類在一起，提示可能存在變異現(xiàn)象。

2013年，世界衛(wèi)生組織稱：禽流感的監(jiān)測(cè)重點(diǎn)在活禽市場(chǎng)，活禽市場(chǎng)這一AIV污染地的存在，加速了AIV發(fā)生基因重組和變異的進(jìn)程，為新型AIV的出現(xiàn)提供了條件。但是，取締活禽市場(chǎng)交易，短期內(nèi)不可能完成，因此應(yīng)該更加重視對(duì)活禽市場(chǎng)的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，及時(shí)反饋當(dāng)前AIV的流行情況，為AIV的防控提供參考支持是可行的。我們的研究結(jié)果也反映出由于沒有采取生物安全的措施，病毒易在活禽市場(chǎng)持續(xù)存在且易發(fā)生重組，交易的家禽極易發(fā)生交叉感染。因此，活禽市場(chǎng)的家禽、特別是水禽在AIV的演化、維持和擴(kuò)散過程中起重要作用，對(duì)活禽市場(chǎng)進(jìn)行長(zhǎng)期不間斷的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)是非常重要的。

4 結(jié) 論

華東地區(qū)活禽市場(chǎng)水禽體內(nèi)攜帶的7株H9N2 AIV與當(dāng)前家禽優(yōu)勢(shì)流行基因型一致，定期監(jiān)測(cè)活禽市場(chǎng)家禽中循環(huán)存在的AIV，對(duì)了解潛在的流行株的演化和出現(xiàn)有重要作用。