魏潤宇，羅瑤瑤，呂 艷，王靜靜，鄭東霞，趙云玲，劉文博，劉華雷*，王志亮*

(1.揚州大學獸醫(yī)學院，揚州225009； 2.中國動物衛(wèi)生與流行病中心，青島 266032；3.青島農(nóng)業(yè)大學，青島 266109; 4.江蘇高校動物重要疫病與人畜共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009)

新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)強毒株感染引起禽的一種急性、高度接觸性烈性傳染病，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將新城疫列為必須報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病，《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012—2020年)》將其列為優(yōu)先防控的重大動物疫病。NDV屬于副黏病毒科、禽腮腺炎病毒屬，是一種有囊膜、單股、負鏈、不分節(jié)段的RNA病毒。新城疫病毒具有遺傳學多樣性，可分為Class Ⅰ和ClassⅡ兩類，每類又可進一步分為多種不同的基因型或基因亞型[1]。Ⅰ類NDV至少包括10種基因型[2]，Ⅱ類NDV至少包括18個基因型[3]。Ⅰ類新城疫病毒主要分布于北美野生水禽和亞洲活禽市場中。除1990年在愛爾蘭分離到Ⅰ類NDV強毒株外，其余分離株均為弱毒株，但現(xiàn)有研究表明，Ⅰ類NDV弱毒株可通過雞氣囊或雞胚連續(xù)傳代后增強毒力[4]。因此，對流行的Ⅰ類NDV進行系統(tǒng)監(jiān)測、分析病毒的流行規(guī)律和變異情況，對新城疫的防控具有重要意義。2008年，我國首次分離到Ⅰ類NDV[5]。近年來主動監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，Ⅰ類NDV在國內(nèi)分布廣泛，流行毒株以基因3型為主，同時存在少量基因2型和基因1型毒株[6]，2015年在廣西活禽市場的家鴨中分離到1株新型Ⅰ類NDV[7]。本研究于2016年在我國部分地區(qū)活禽市場開展新城疫主動監(jiān)測，分離到4株新型Ⅰ類NDV，并對分離株進行F基因序列分析和遺傳進化分析，為進一步了解我國Ⅰ類NDV的分子特征奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2016年在全國新城疫主動監(jiān)測過程中從江蘇和寧夏活禽市場中采集的家禽棉拭子樣品。

1.2 病毒分離與鑒定

將采集的拭子樣品按照常規(guī)方法接種9～11日齡SPF雞胚進行病毒分離與鑒定，將鑒定為血凝陽性的尿囊液與NDV標準血清進行血凝抑制試驗，鑒定為NDV陽性的尿囊液于-80 ℃保存。對分離到的NDV采用蝕斑純化法[8]進行純化，將純化后的病毒置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA提取、RT-PCR和序列測定

采用Roche的 High Pure Viral RNA Kit提取病毒RNA。參考GenBank中NDV序列，設(shè)計了用于鑒定Ⅰ類NDV的特異性引物(表1)，利用Primer-ScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2(TaKaRa)進行常規(guī)RT-PCR擴增，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定為陽性的樣品，送至大連TaKaRa公司測序。

表1 新城疫病毒鑒定引物及F基因擴增引物

1.4 F基因的RT-PCR擴增

根據(jù)GenBank中NDV序列，設(shè)計F基因擴增引物序列(表1)，利用Super-Script III One-Step RT-PCR PlatinumTaqHiFi(Invitrogen) 擴增F基因，擴增產(chǎn)物送至大連TaKaRa公司測序。

1.5 F基因的序列分析和遺傳進化

利用DNAStar軟件，對病毒F基因序列進行拼接、編輯和同源性比較。利用MEGA軟件，對病毒的F基因與GenBank中公布的Ⅰ類新城疫參考株(表2)進行比對和遺傳進化分析。采用鄰位相連法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，bootstrap設(shè)置1 000次重復。

表2 CⅠ新城疫病毒信息

2 結(jié) 果

2.1 病毒分離與鑒定

樣品接種于SPF雞胚后，經(jīng)血凝和血凝抑制試驗，成功鑒定出4株Ⅰ類新城疫病毒(表3)，電泳圖見圖1，分離株地理分布見表3。

2.2 F基因擴增與序列分析

對4株分離株進行F基因擴增和序列分析，分離株F基因編碼區(qū)長度均為1 662 nt，共編碼553個氨基酸，裂解位點氨基酸序列均為112ERQERL117，具有NDV弱毒株的典型分子特征。4株病毒F蛋白均含有12個半胱氨酸(分別位于aa76、aa199、aa338、aa347、aa362、aa370、aa394、aa399、aa401、aa424、aa514、aa523)和6個糖基化位點(分別位于aa86、aa192、aa367、aa448、aa472、aa542)。4株 分離株與新城疫病毒F蛋白功能區(qū)參考序列[9]相比：融合肽(fusion peptide)有5處變異，七肽重復區(qū)(HRa、HRb、HRc)各有2處變異，跨膜區(qū)(transmembrane domain)有6處氨基酸變異(表4)。通過與50株CⅠ新城疫病毒(表2)F蛋白功能區(qū)比較發(fā)現(xiàn)：4株分離株與CⅠ的NDV F蛋白功能區(qū)氨基酸一致，不存在變異現(xiàn)象(表4)。

同源性分析結(jié)果顯示，3株寧夏分離株F蛋白氨基酸相似性為100%，與江蘇分離株(JS2145)相似性為97.9%。4株分離株與Ⅰ類NDV基因1～10型代表株相似性為80.4%～98.0%，與北美分離株[10](Greater Black-backed Gull/USA/NJ/AI10-835)相似性最高(97.7%～99.3%)，而與2015年國內(nèi)Ⅰ類新型分離株(duck/Guangxi/1261/2015)相似性僅為95.5%～97.0%(表5)。

表3 本研究中4株Ⅰ類NDV分離株的詳細信息

M. DL2000 相對分子質(zhì)量標準; 1. JS2145分離株; 2. NX2206分離株; 3. NX2207分離株; 4. NX2209分離株; 5. 陽性樣品M. DL2000 marker; 1. JS2145 isolate; 2. NX2206 isolate; 3. NX2207 isolate; 4. NX2209 isolate; 5. Positive sample圖1 4株新城疫病毒F基因的RT-PCR擴增Fig.1 RT-PCR amplification of F gene of 4 Class I Newcastle disease viruses

2.3 遺傳進化分析

根據(jù)GenBank中下載的NDV參考序列，利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。F基因(47—420 nt)遺傳進化分析結(jié)果顯示，4株分離株均為Ⅰ類新城疫病毒，但不屬于基因型1～10(圖2)。隨后，利用完整F基因編碼區(qū)序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[11]，結(jié)果顯示，4株病毒均為1c亞型，與北美分離株相似性最高(圖3)，雖與2015年我國廣西分離株(duck/Guangxi/1261/2015)所屬分支相同，但仍具有一定的差異性(圖3)。

3 討 論

3.1 Ⅰ類新城疫毒力及抗原性的演化

1990年愛爾蘭暴發(fā)的新城疫是由ClassⅠ強毒株引起，分離株與該地區(qū)水鳥源無毒株親緣關(guān)系很近，這是迄今為止唯一關(guān)于ClassⅠ新城疫病毒導致疫病流行的報道[12]。NDV最早是以弱毒形式存在，在多種壓力之下才逐漸進化為強毒[13]，1999—2000年，澳大利亞暴發(fā)新城疫病原株是由1998年之前當?shù)亓餍械蘑裥腿醵局暄莼鴣怼?005年，仇旭升等[14]分離到一株基因Ⅲ型新城疫病毒，與Ⅰ系苗Mukteswar相似性在99%以上，毒力卻明顯增強。秦卓明等[15]以La Sota、Clone30等疫苗株和經(jīng)典強毒株F48E9為對照，對國內(nèi)2001—2004年間分離的13株NDV進行了雞胚中和試驗，結(jié)果表明：La Sota與Clone30和F48E9之間的中和相關(guān)指數(shù)(R)較高，但與目前流行株的中和相關(guān)指數(shù)普遍偏低。

表4 I類新城疫病毒F蛋白功能區(qū)氨基酸替代分析

a. 共有序列來自不同基因型的新城疫病毒株[9];b. CⅠ毒株共有序列來自 GenBank中的40株CⅠ型的新城疫病

a. The consensus amino acid sequence was derived from NDV strains of different genotypes[9];b. Consensus of CⅠ strains was derived from 40 NDV strains of CⅠ from GenBank ClassⅠ新城疫毒株的宿主主要為易于遷徙的水禽和野鳥，容易導致NDV由野鳥或水禽向家禽中轉(zhuǎn)移，進而演化為強毒株[4]。Ⅰ類新城疫病毒在我國分布廣泛[3]，盡管目前的監(jiān)測結(jié)果證實大多數(shù)分離株存在于活禽市場等流通環(huán)節(jié)，但仍需加強活禽市場監(jiān)管，強化消毒、定期休市等措施，避免新城疫病毒向養(yǎng)殖場傳播，降低病毒返強的風險。

表5 新城疫病毒F蛋白氨基酸相似性比較

(轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

本文中的新城疫病毒分離株用▲標示，GX1261用△標示 NDV isolates used in the study were labeled by▲, GX1261 were labeled by△圖2 Ⅰ類新城疫病毒F基因(47—420 nt)遺傳進化樹Fig.2 The phylogenetic tree of F gene(47-420 nt)among Newcastle disease virus of Class Ⅰ

▲.新城疫分離株▲.NDV isolates used in the study圖3 Ⅰ類新城疫病毒F基因遺傳進化樹Fig.3 The phylogenetic tree of F gene among Newcastle disease virus of Class Ⅰ

3.2 我國新出現(xiàn)的Ⅰ類NDV的流行現(xiàn)狀

本研究中分離的4株Ⅰ類NDV 與北美分離株的F蛋白氨基酸相似性較高，與duck/Guangxi/1261/2015的相似性僅為95.5%～97.0%。其中分離株Duck/China/NX2206/2016、Duck/China/NX2207/2016、Duck/China/NX2209/2016 F氨基酸相似性為100%，提示這3株分離株可能有共同的來源，此3株分離株與Duck/China/JS2145/2016的氨基酸相似性為97.9%。

用F基因47—420 nt高變區(qū)序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，4株病毒均屬于Ⅰ類新城疫病毒，與基因5型遺傳進化關(guān)系較為接近，但與基因5型代表株所在分支的bootstrap值較低，與2015年國內(nèi)分離到的Ⅰ類未知基因型毒株(GX1261)在遺傳關(guān)系上也存在一定差異。利用F基因編碼區(qū)全長序列進行遺傳進化分析，結(jié)果顯示，4株病毒和2015年國內(nèi)Ⅰ類分離株(GX1261)同屬于基因1c亞型，與北美分離株位于同一分支(Group 3)，此結(jié)果與F蛋白同源性分析結(jié)果一致。

基因分型結(jié)果說明，這4株病毒為我國新出現(xiàn)的Ⅰ類新城疫病毒，雖然與GX1261相似性較高，但仍存在一定差異。由于缺乏全球Ⅰ類新城疫病原學監(jiān)測數(shù)據(jù)，至今無法確定此類病毒的確切來源與傳播途徑。根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)推測，該病毒出現(xiàn)于我國可能與帶毒候鳥的長距離遷徙有關(guān)。目前，雖然只在寧夏、江蘇和廣西的水禽(鴨)中分離到這種新型NDV，但水禽被認為是NDV的自然宿主，在貯存和傳播病毒方面具有重要作用，而水禽和陸禽的混合飼養(yǎng)也給病毒的傳播和擴散帶來便利。因此，應(yīng)加強Ⅰ類NDV的系統(tǒng)監(jiān)測，同時避免水禽和陸禽的混合飼養(yǎng)，防止病原進一步擴散和毒力返強。

4 結(jié) 論

2016年分離到4株Ⅰ類新城疫病毒，其F基因編碼長度均為1 662 nt，編碼553個氨基酸，毒株間氨基酸相似性為97.9%～100%。分離株F蛋白裂解位點的氨基酸組成均為112ERQERL117，符合弱毒株的分子特征。F基因高變區(qū)(47—420 nt)遺傳進化分析結(jié)果提示這4株病毒為國內(nèi)新出現(xiàn)的基因型，屬于基因1c亞型，與北美分離株高度同源。