任龍飛，董誠明，蘇秀紅*，杜真輝

(1.河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450000；2.呼吸疾病河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450000)

淫羊藿是小檗科淫羊藿屬EpimediumLinn.植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，列為中品，應用歷史較長，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功效。中國的淫羊藿屬植物有55種，形成藥材商品的有15種，其中有7種為主要應用品種[2]。2015版《中華人民共和國藥典》[3]收載做為淫羊藿藥材的有：淫羊藿E.brevicomuMaxim.、箭葉淫羊藿E.sagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.、柔毛淫羊藿E.pubescensMaxim.或朝鮮淫羊藿E.koreanumNakai.。

采收是中藥生產(chǎn)過程中的重要環(huán)節(jié)，是中醫(yī)臨床安全有效用藥的前提采收時期影響中藥質(zhì)量和產(chǎn)量，開展中藥適時采收期的研究具有重要意義和應用價值。目前關(guān)于箭葉淫羊藿化學成分、質(zhì)量控制、炮制工藝、提取工藝、藥理作用等的研究較多，但是關(guān)于箭葉淫羊藿采收期的研究較少。筆者研究不同采收期對箭葉淫羊藿產(chǎn)量及品質(zhì)的影響，旨在探尋箭葉淫羊藿的適宜采收期，為其合理采收，安全用藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 材料

箭葉淫羊藿采集于河南省駐馬店市平輿縣種植基地。經(jīng)河南中醫(yī)藥大學董誠明教授鑒定為小檗科淫羊藿屬箭葉淫羊藿Epimediumsagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim。自2016年3月30日起，每月采集一次地上部分測定生物量，每次采收4 m2，10月30日采集最后一次，去除莖和葉柄后，烘干打粉備用。

1.2 試劑與儀器

Waters e2695 高效液相色譜(沃特世科技(上海)有限公司)，朝霍定A(批號：MUST-16042902)、朝霍定B(批號：MUST-16042902)、朝霍定C(批號：MUST-16042902)、淫羊藿苷(批號MUST-16042902)成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C，淫羊藿苷的測定

2.1.1 對照品的制備 分別精密稱取朝藿定A、B、C和淫羊藿苷對照品適量，加甲醇配制成每1 mL含朝藿定A 230 μg、朝藿定B 598 μg、朝藿定C 654 μg、淫羊藿苷4044 μg的混合對照品溶液，置于4 ℃冰箱保存。

供試品溶液的制備 精密稱量過60目篩的淫羊藿藥材粉末1 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密量取20 mL 50%乙醇加入，稱定重量，超聲(200 W，40 KHZ)20 min，用50%乙醇補足重量，過濾，取續(xù)濾液，用于測定朝藿定A、B和淫羊藿苷。另取供試品溶液0.5 mL，用甲醇稀釋至50 mL，過濾，取續(xù)濾液用于測定朝藿定C。

2.1.2 色譜條件 色譜柱Unitary C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：乙腈-水(25∶75)，柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1，檢測波長：270 nm，進樣量10 μL。

2.1.3 線性關(guān)系考察 將上述混合對照品溶液稀釋成6個不同的濃度，按2.1.2項下色譜條件測定。以進樣濃度(μg·mL-1)為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，得到朝藿定A、B、C和淫羊藿苷的回歸方程分別為：Y=1.754 2×106X-7.479 4×104(r=0.999 1)，線性范圍為0.132～2.300 μg；Y=1.995 8×106X-1.717 1×105(r=0.999 4 )，線性范圍為0.204～5.980 μg；Y=2.107 2×106X-2.318 4×105(r=0.999 3)，線性范圍為0.082～6.54 μg；Y=2.205 8×106X+4.452×105(r=0.999 2)，線性范圍為0.202～40.44 μg。標準品和樣品測定圖譜見圖1，含量測定結(jié)果見表1。

2.1.4 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，分別計算4個黃酮類成分峰面積的RSD值在0.75%～1.77%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復性試驗 稱取同一樣品5份，按照2.1.2項下方法制備供試品溶液，進行測定，計算各黃酮類成分的質(zhì)量分數(shù)RSD在1.18%～2.45%，表明方法重復性良好。

注：a.標準品；b.樣品圖；1.朝藿定A；2.朝藿定B；3.朝藿定C；4.淫羊藿苷。圖1 箭葉淫羊藿HPLC

表1 不同采收期各指標的測定結(jié)果

注：不同小寫字母表示差異顯著性具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進行測定，計算4個黃酮類成分的峰面積RSD值在0.75%～1.38%，表明供試品溶液在24 h穩(wěn)定性良好。

2.1.7 加樣回收試驗 精密稱取精密稱取已知含量的同一批藥材粉末0.5 g，共6份，置于具塞錐形瓶中，加入稀釋過的對照品溶液，按照2.1.2項下方法測定，計算回收率。朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C，淫羊藿苷的平均回收率分別為：98.16%、98.06%、99.69%、98.43%，RSD值均<3%。

2.2 數(shù)據(jù)結(jié)果采用DPS 9.0新復極差法進行單因素分析。

2.3 不同采收期測定結(jié)果比較

由表1可知，3月30日采收的淫羊藿葉片中四種黃酮類成分均顯著高于其它各組，但是產(chǎn)量最低。隨著栽培時間的增加，產(chǎn)量逐漸增加，到8月31日產(chǎn)量達到最大值，之后有所下降。但是8月31日的含量并不高，因此需要對數(shù)據(jù)進行進一步的分析，對產(chǎn)量和質(zhì)量進行綜合評價，來確定適宜采收期。

2.4 數(shù)據(jù)分析

對以上數(shù)據(jù)選擇產(chǎn)量與四種黃酮類成分之和相乘的數(shù)據(jù)進行評價，即OD=產(chǎn)量×(朝藿定A含量+朝藿定B含量+朝藿定C含量+淫羊藿苷含量)，結(jié)果如表2。

根據(jù)產(chǎn)量和含量相乘的結(jié)果來看，適宜采收日期依次為8月31日>7月30日>9月30日>10月30日>6月30日>5月31日>4月30日>3月30日，8月31日前后為適宜采收日期，3月30日采收效果最差。

3 討論與結(jié)論

前期實驗對不同采收期的箭葉淫羊藿做了質(zhì)量檢查，其水分、灰分、浸出物含量均符合中國藥典規(guī)定。淫羊藿苷不得少于0.50%也完全符合藥典規(guī)定，值得注意的是本實驗測得的朝藿定C含量遠高于其它黃酮成分。

朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C和淫羊藿苷均表現(xiàn)為3月30日生長初期最高，但其大部分是植株的嫩葉，產(chǎn)量最低并不適宜采收。4月份其含量顯著降低，可能與開花結(jié)果，消耗較多養(yǎng)分有關(guān)，張祖榮[4]研究了開花結(jié)果對牡丹丹皮產(chǎn)量及質(zhì)量的影響，結(jié)果表明摘蕾處理組丹皮產(chǎn)量及質(zhì)量顯著高于自然開花組。5月份，6月份箭葉淫羊藿葉片尚未完全展開，葉片的生物產(chǎn)量小，折干率低，也不適宜采收。箭葉淫羊藿的產(chǎn)量在8月份顯著高于其他月份，含量與7、9、10月份差別不大，最終確定8月份為最適宜采收時期。

采收期的確定要結(jié)合產(chǎn)量和含量，目前關(guān)于淫羊藿的采收期，潘丕克[5]發(fā)現(xiàn)不同品種、不同栽培地的淫羊藿采收期也不相同。于俊林[6]通過測定朝鮮淫羊藿不同采收期的淫羊藿苷和總黃酮含量，表明8月份采收最好；張崇喜[7]研究朝鮮淫羊藿，綜合考慮淫羊藿苷和黃酮含量，選擇9月中旬為最佳采收期；何順志[8]研究不同生長期黔產(chǎn)天平山淫羊藿和粗毛淫羊藿葉片中淫羊藿苷和總黃酮的含量，確定4～5月的果期為最佳采收期，文中雖然提到結(jié)合產(chǎn)量和質(zhì)量綜合考慮確定采收期，但未見其產(chǎn)量數(shù)據(jù)。結(jié)合黃酮含量和產(chǎn)量，對各個采收期的箭葉淫羊藿進行綜合評價，篩選出適宜采收時期為8月31日前后。但是關(guān)于箭葉淫羊藿適宜采收量，還有待進一步研究，因為在基地中發(fā)現(xiàn)，采收量的多少會影響下一年的分枝數(shù)。