馮文軍 李文春 解黎雯 李殿明 付饒
摘 要:目的:建立雙黃連粉針劑中總糖的含量測(cè)定方法。方法:以葡萄糖為對(duì)照品,以改良硫酸-蒽酮分光光度法測(cè)定雙黃連粉針劑糖總糖的含量。結(jié)果:供試液在50分鐘內(nèi)顯色穩(wěn)定,重現(xiàn)性好,平均回收率為99.88%,RSD為1.83%。雙黃連粉針劑總糖含量為37.72%。結(jié)論:該方法簡(jiǎn)便,快速,測(cè)定結(jié)果客觀,準(zhǔn)確。
關(guān)鍵詞:雙黃連粉針劑;總糖;含量測(cè)定;改良硫酸-蒽酮法
中圖分類號(hào):R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1671-2064(2018)13-0186-03
根據(jù)中藥注射劑安全性再評(píng)價(jià)的相關(guān)要求,《中藥注射劑安全性再評(píng)價(jià)質(zhì)量可控性評(píng)價(jià)技術(shù)原則》(征求意見(jiàn)稿)明確指出:“多成份制成的注射劑結(jié)構(gòu)明確成分的含量因品種而異;所測(cè)各類成分之和應(yīng)盡可能大于總固體的80%?!薄岸喑煞葜瞥傻淖⑸鋭瑴y(cè)指標(biāo)的選擇應(yīng)為大類成份含測(cè)加單一成份含測(cè),如:某注射劑中含黃酮、皂苷、生物堿等,需要分別建立總黃酮、總皂苷、總生物堿類的測(cè)定,還需分別對(duì)黃酮、皂苷、生物堿中的單一代表成份進(jìn)行含量含測(cè)(HPLC或GC法等)。”因此建立雙黃連粉針劑的總糖含量測(cè)定指標(biāo),以加強(qiáng)制劑質(zhì)量控制。
1 儀器與試藥
METTLER XS205型 電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(瑞士)公司);TU-1901型 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);取液器(Eppendorf Research,0.2mL、1mL、5mL);具塞玻璃試管(10mL);石英比色杯;D-葡萄糖(分析純,北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司);蒽酮(分析純,中國(guó)上海五聯(lián)化工廠);硫酸(分析純,吉林威龍化學(xué)試劑有限公司);0.2%蒽酮硫酸溶液[稱取0.2g蒽酮,溶于濃硫酸(98%)100mL中,冷卻至室溫,貯于具塞棕色瓶?jī)?nèi)(臨用現(xiàn)配)];雙黃連粉針劑(哈藥集團(tuán)中藥二廠,噴干,規(guī)格:0.6g,0903237、0903238、0903239、1001230、1001231、1001232、1005206、1005207、1005208);注射用雙黃連(哈藥集團(tuán)中藥二廠,凍干,規(guī)格:0.6g,0902004、0902005、0902006);注射用雙黃連(哈藥集團(tuán)中藥二廠,凍干,規(guī)格:1.2g,1002102、1002103、1002104)。
2 試驗(yàn)方法與結(jié)果
2.1 試驗(yàn)方法
通過(guò)對(duì)糖含量方法的反應(yīng)原理研究,認(rèn)為硫酸-蒽酮法測(cè)定可溶性糖較適合雙黃連粉針劑中總糖的含量測(cè)定,研究中該方法有兩種顯色方式[1-2],即一種在沸水中加熱10分鐘,另一種是應(yīng)用硫酸加入供試品溶液中發(fā)熱反應(yīng)顯色稱之為改良硫酸-蒽酮法(硫酸水合熱法),通過(guò)文獻(xiàn)認(rèn)為,改良法較經(jīng)典法更加科學(xué),方便簡(jiǎn)單,因此雙黃連粉針劑總糖的含量測(cè)定采用改良法硫酸-蒽酮法。
2.1.1 對(duì)照品溶液的制備
精密稱取葡萄糖100mg,置100mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,混勻得1mg/mL葡萄糖對(duì)照品溶液。精密吸取10mL至100mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,即得(每1mL 含葡萄糖100μg)。
2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
精密量取對(duì)照品溶液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL,分別置10mL具塞試管中,各加水至2mL,加0.2%蒽酮濃硫酸溶液5mL,搖勻,避光放置30分鐘,以0mL為空白,照分光光度法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄ⅤA),在620nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度,以吸收度為縱坐標(biāo),對(duì)照品重量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.1.3 供試品溶液的制備
取本品10mg,精密稱定,置100mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密吸取2mL置10mL具塞試管中,照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法,自“加0.2%蒽酮濃硫酸溶液5mL……”起依法測(cè)定吸收度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中葡萄糖的重量,計(jì)算,即得。
2.2 顯色條件研究
文獻(xiàn)研究得知,顯色的主要因素是硫酸與水的比例,通過(guò)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)考察硫酸與水的不同比例,確定最佳的顯色比例。
試驗(yàn)方法:精密量取對(duì)照品溶液0.6mL,分別置10mL具塞試管中,各加水至1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL,加0.2%蒽酮濃硫酸溶液5mL,搖勻,避光放置30分鐘,同時(shí)制備空白,照分光光度法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄ⅤA),在620nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度,同時(shí)檢測(cè)1小時(shí),每10分鐘測(cè)一次,記錄結(jié)果。
試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。
通過(guò)實(shí)驗(yàn)認(rèn)為顯色穩(wěn)定性均較好,僅2.5mL時(shí)偏差較大,2.0mL時(shí)的最大吸收波長(zhǎng)與文獻(xiàn)報(bào)道620nm一致,且吸收適中因此采用該加水比例顯色。
2.3 最大吸收波長(zhǎng)的確定
吸取對(duì)照品溶液0.6mL和供試品溶液2.0mL分別置10mL具塞試管中,各加水至2mL,加0.2%蒽酮濃硫酸溶液5mL,搖勻,避光放置30分鐘,以水2.0mL如上法操作得空白溶液,于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上,在400~800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果對(duì)照品溶液在620.5nm波長(zhǎng)處均有最大吸收,由于成品中含有多種糖故最大吸收與葡萄糖有差異,600.5nm,但其吸收在600-620nm之間幾乎為平臺(tái)變化很小,我們采用葡萄糖為標(biāo)品,故確定測(cè)定葡萄糖的最大吸收波長(zhǎng)620nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。葡萄糖對(duì)照品紫外圖譜如圖1所示,雙黃連粉針供試品溶液紫外圖譜如圖2所示。
2.4 線性關(guān)系的考察
研究方法:精密稱取葡萄糖12.5mg,置100mL量瓶中,加水適量,使溶解,并稀釋至刻度,搖勻,即得(每1mL含葡萄糖0.10mg)。照2.1.2項(xiàng)下方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以對(duì)照品量為橫坐標(biāo),吸收度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程為:Y=5.14433X-0.04034,相關(guān)系數(shù)為:r=0.9988。表明黃芩苷在0.025mg~ 0.125mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。
2.5 精密度試驗(yàn)
取注射用雙黃連(凍干)1002102,精密稱定,2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液。依法進(jìn)行測(cè)定6次。測(cè)定吸收值,結(jié)果平均值為0.3878,RSD=0.11%。由此可見(jiàn),該方法精密度較好。
2.6 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)
取注射用雙黃連(凍干)1002102,精密稱定,照2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液。依法測(cè)定,分別在0小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)測(cè)定。測(cè)定吸收值,結(jié)果平均值為0.3693,RSD=1.63%。該方法雙黃連粉針劑的水溶液,在室溫條件下密閉放置6小時(shí),穩(wěn)定性良好。
2.7 顯色穩(wěn)定性試驗(yàn)
取注射用雙黃連(凍干)1002102,精密稱定,照2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液。依法測(cè)定,之后每隔10min測(cè)定一次。測(cè)定吸收值,結(jié)果平均值為0.4853,RSD=1.16%。該方法50分鐘內(nèi)顯色穩(wěn)定性較好。但隨時(shí)間延長(zhǎng)吸收度略有降低趨勢(shì),因此建議30分鐘內(nèi)測(cè)定完成。
2.8 重復(fù)性試驗(yàn)
取注射用雙黃連(凍干)1002102,精密稱定6份,每份與約10mg,照2.1.3項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液。依法測(cè)定。測(cè)定含量值,結(jié)果含量均值為38.725%,RSD=2.42%。由此可見(jiàn),該方法重復(fù)性較好。
2.9 回收率試驗(yàn)
取注射用雙黃連(凍干)1002102,精密稱定6份,每份與約5mg,同時(shí)各精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液(相當(dāng)葡萄糖2.10mg),分別加入上述6個(gè)量瓶中,照2.1.3項(xiàng)下方法制備6個(gè)供試品溶液。依法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。
由此可見(jiàn),該方法加樣回收率較好。
2.10 樣品測(cè)定
分別依照2.1項(xiàng)下規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)15批(凍干6批、噴干9批)雙黃連粉針劑的含量測(cè)定,15批粉針的總糖平均含量為37.72%。結(jié)果見(jiàn)表3。
3 討論
(1)張純等[3]報(bào)道經(jīng)典的硫酸蒽酮法的反應(yīng)條件100℃下,反應(yīng)時(shí)間10min,測(cè)定波長(zhǎng)620nm。在采用該法測(cè)定牛膝多糖時(shí)發(fā)現(xiàn)其最大吸收波長(zhǎng)并不在620nm處,并時(shí)常碰到波峰的漂移情況。引起測(cè)定結(jié)果的誤差。反應(yīng)溫度是導(dǎo)致波峰漂移的主要原因,隨著反應(yīng)溫度的升高,最大吸收波長(zhǎng)向短波長(zhǎng)方向漂移。這可能與溫度升高后,糖醛衍生物與蒽酮縮合鏈增長(zhǎng)有關(guān)。但筆者研究發(fā)現(xiàn),改良硫酸-蒽酮法(硫酸水合熱法)隨著加水量減少最大吸收波長(zhǎng)向短波長(zhǎng)方向漂移。但加水量固定,顯色穩(wěn)定快速。雙黃連中的總糖顯色也與葡萄糖略有差別,可能是雙黃連中含有多種糖的原因。(2)蒽酮法的靈敏度較高需要較少的樣品即可達(dá)到含量測(cè)定的目的,更適合對(duì)混合糖的總糖含量測(cè)定,雙黃連粉針劑中根據(jù)研究[4]糖類成分超過(guò)20%,其中含量較大的有果糖、葡萄糖、蔗糖(非還原糖),另還含有赤蘚醇、鼠李糖、阿拉伯糖、阿拉伯糖醇、甘露糖、D-半乳糖、肌醇、甘露醇、山梨糖醇等。采用改良硫酸蒽酮法測(cè)定雙黃連中的總糖應(yīng)具有可行性。
參考文獻(xiàn)
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[2]林炎坤.常用的幾種蒽酮比色定糖法的比較和改進(jìn)[J].植物生理學(xué)通訊,1989,(4):53-55.
[3]張純,郭文彪,王雯佶,等.改良硫酸蒽酮比色法測(cè)定牛膝多糖的含量[J].中華臨床醫(yī)藥雜志,2004,4(19):17-18.
[4]中國(guó)藥品生物制品檢定所中藥與民族藥檢驗(yàn)檢測(cè)中心.注射用雙黃連(凍干)化學(xué)成分研究報(bào)告[R].2010年1月,哈藥集團(tuán)中藥二廠內(nèi)部資料.