李璟 蔣娜 王晶晶 馬興建 王家賓

摘 要：目的 觀察右美托咪定對(duì)H9C2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用。方法 H9C2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為三組：正常對(duì)照組（Control）、缺氧/復(fù)氧組（H/R）、Dex（5 μmol/L）干預(yù)H/R組。Dex干預(yù)H/R組先用Dex預(yù)處理6 h后，再經(jīng)缺氧/復(fù)氧處理。采用倒置顯微鏡觀察各組H9C2心肌細(xì)胞形態(tài)的變化，檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH的含量，CCK-8法檢測(cè)各組H9C2心肌細(xì)胞的存活率，試劑盒檢測(cè)caspase-3活性，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡并計(jì)算凋亡指數(shù)。結(jié)果 與Control組相比，H/R組細(xì)胞皺縮，大量死亡，細(xì)胞活力降低，培養(yǎng)基中LDH含量增加，caspase-3活性增加，細(xì)胞凋亡指數(shù)增加，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P<0.01）；Dex預(yù)處理可明顯改善H/R處理后細(xì)胞形態(tài)，提高細(xì)胞活力，減少LDH含量和caspase-3活性，降低細(xì)胞凋亡指數(shù)，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P<0.01）。結(jié)論 Dex可通過(guò)減少H9C2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧引起的細(xì)胞凋亡減輕損傷。

關(guān)鍵詞：右美托咪定；H9C2；缺氧/復(fù)氧；細(xì)胞凋亡

中圖分類號(hào)：R917 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.09.025

文章編號(hào)：1006-1959（2018）09-0083-04

Abstract：Objective To observe the protective effects of dexmedetomidine on hypoxia/reoxygenation injury of H9C2 cardiomyocytes. Methods H9C2 cardiomyocytes were randomly divided into three groups： normal control group（Control），hypoxia/reoxygenation group （H/R）and Dex（5μmol/L）intervention group.Dex intervention in group H/R was treated with Dex pretreatment for 6 h before anoxia/ reoxygenation.The morphologic changes of H9C2 cardiomyocytes in each group were observed by inverted microscope.The content of LDH in the cell culture medium of each group was detected.The survival rate of H9C2 cardiomyocytes in each group was detected by CCK-8 method.The activity of caspase-3 was detected by the kit.The apoptosis was detected by TUNEL method and the apoptosis index was calculated.Results Compared with the Control group，the cells in the H/R group were shrinking，a large number of deaths， the decrease of cell vitality，the increase of LDH content in the medium，the increase of the activity of caspase-3，the increase of the apoptosis index，and the significant statistical significance（P<0.01）.Dex pretreatment could obviously improve the morphology of the cells after H/R treatment，raise the vitality of the cells，reduce the content of LDH and caspase-3 activity decreased the apoptotic index，and the difference was statistically significant（P<0.01）.Conclusion Dex can reduce the injury of H9C2 cardiomyocytes induced by hypoxia/reoxygenation.

Key words：Dexmedetomidine；H9C2；Hypoxia/Reoxygenation；Apoptosis

缺血性心臟病是導(dǎo)致死亡的一類主要的心血管疾病，嚴(yán)重危害人類健康，及時(shí)有效的恢復(fù)缺血心肌的血流-即再灌注，是臨床治療的首選，然而缺血心肌恢復(fù)血流的同時(shí)會(huì)加重心肌損傷和能量代謝障礙，形成心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury， MIRI）[1-3]。右美托咪定（dexmedetomidine， Dex）是一種新型的高選擇性α2受體激動(dòng)劑，被廣泛應(yīng)用于心血管手術(shù)的麻醉，并收到了較好的效果。Dex在心血管疾病中發(fā)揮保護(hù)作用，但具體機(jī)制仍不清楚。Dex具有劑量依賴性的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮和抑制交感神經(jīng)興奮等作用，且對(duì)呼吸、循環(huán)的抑制作用輕微[8-10]。Dex對(duì)心肌的保護(hù)作用受到越來(lái)越多的關(guān)注，普遍認(rèn)為Dex是通過(guò)抑制交感中樞活動(dòng)，降低心率，降低心肌氧耗，改善心肌氧供需平衡，但具體機(jī)制仍未闡明。本研究采用H9C2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，觀察Dex預(yù)處理對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷的影響及其可能機(jī)制，現(xiàn)分析如下。

1材料與方法

1.1材料與儀器 H9C2心肌細(xì)胞系購(gòu)買自深圳百恩維公司；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；0.25 %胰蛋白酶購(gòu)自Sigma公司；鹽酸右美托咪定購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司（200 μg/2 ml）；CCK-8細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自七海生物公司；LDH檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，抗Bcl2、抗Bax和抗GAPDH抗體均購(gòu)自Cell Signaling公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠和山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備儀器廠；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo公司；低速離心機(jī)購(gòu)自賽特湘儀公司；Western-blot相關(guān)儀器均購(gòu)自Bio-Rad公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自SpectraMax公司。

1.2 H9C2心肌細(xì)胞的培養(yǎng)和H/R模型的建立用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中孵育H9C2細(xì)胞；H/R模型通過(guò)將H9C2細(xì)胞正常培養(yǎng)基換為無(wú)血清的DMEM并在缺氧箱中處理12 h，之后將無(wú)血清的DMEM換成含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液后放入正常培養(yǎng)箱中孵育4 h。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組將H9C2細(xì)胞隨機(jī)分為三組：正常對(duì)照組（Control）、缺氧/復(fù)氧組（H/R）和右美托咪定干預(yù)缺氧/復(fù)氧組（Dex+H/R）。Dex+H/R 組先用Dex預(yù)處理6 h，再進(jìn)行H/R處理。

1.4 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞活力各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將培養(yǎng)基倒掉，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，再加入100 μl無(wú)血清的培養(yǎng)液和10 μl CCK-8檢測(cè)液，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值，波長(zhǎng)為450 nm。

1.5 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集每組培養(yǎng)瓶中細(xì)胞培養(yǎng)液，嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所提供的檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值，波長(zhǎng)為450 nm，將各組讀數(shù)與Control組比較。

1.6 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用PBS清洗3次，10 min/次；用0.1 %的Triton-X室溫破膜10 min，再用PBS洗3次，10min/次；按照TUNEL試劑盒說(shuō)明，將1號(hào)液和2號(hào)液按1：9混合，37 ℃水浴避光孵育2 h；再用PBS洗3次，10 min/次，DAPI染液避光染核37 ℃水浴10 min，再用PBS洗3次，10 min/次。激光共聚焦顯微鏡拍照，細(xì)胞凋亡指數(shù)=綠色細(xì)胞核數(shù)/藍(lán)色細(xì)胞核數(shù)×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用（x±s）表示，用單因素方差分析比較兩組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并用Bonferroni法進(jìn)行校正，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。

2結(jié)果

2.1 Dex對(duì)H/R損傷后H9C2細(xì)胞活力的影響與Control組相比，H/R處理后降低H9C2細(xì)胞活力（P<0.01），倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞皺縮，大量死亡；與H/R組相比，Dex干預(yù)H/R組細(xì)胞活力得到改善（P<0.01），細(xì)胞皺縮減輕，死亡減少，見(jiàn)圖1。

2.2 Dex對(duì)H/R損傷后H9C2細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量的影響與Control組相比，H/R處理后培養(yǎng)液中LDH含量升高（P<0.01）；與H/R組相比，Dex干預(yù)H/R組培養(yǎng)液中LDH含量降低（P<0.01），見(jiàn)圖2。

2.3 Dex對(duì)H/R損傷后H9C2細(xì)胞caspase-3活性的

影響與Control組相比，H/R處理后培養(yǎng)液中LDH含量升高（P<0.05）；與H/R組相比，Dex干預(yù)H/R組培養(yǎng)液中LDH含量降低（P<0.05），見(jiàn)圖3。

2.4 Dex對(duì)H/R損傷后H9C2細(xì)胞凋亡的影響與Control組相比，H/R處理后細(xì)胞凋亡增加，凋亡指數(shù)增大（P<0.01）；與H/R組相比，Dex干預(yù)H/R組后細(xì)胞凋亡減少，凋亡指數(shù)降低（P<0.01），見(jiàn)圖4。

3討論

心臟缺血/再灌注損傷已經(jīng)成為制約缺血性心臟病患者預(yù)后的重要因素，極大的限制了臨床上藥物溶栓、動(dòng)脈搭橋術(shù)和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)等的治療效果。如何有效減輕缺血/再灌注損傷成為了心血管研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)。Dex作為一種新型的α腎上腺素受體高選擇性激動(dòng)劑，具有劑量依賴性的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮和抑制交感神經(jīng)興奮等作用，且對(duì)呼吸、循環(huán)的抑制作用輕微 [4-6]。Dex對(duì)心肌的保護(hù)作用受到越來(lái)越多的關(guān)注，普遍認(rèn)為Dex是通過(guò)抑制交感中樞活動(dòng)，降低心率，降低心肌氧耗，改善心肌氧供需平衡，但具體機(jī)制仍未闡明。

以往研究表明，Dex預(yù)處理可激活α腎上腺素能受體，減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷。Dex還可能通過(guò)抑制mPTP的開(kāi)放及線粒體ATP敏感性鉀通道（mitochondrial ATP-sensitive potassium channel， mitoKATP）的活性減少心肌損傷[4，7]。細(xì)胞凋亡是心肌細(xì)胞損傷的重要機(jī)制，是由基因控制的程序化死亡過(guò)程[4]。有研究證實(shí)，細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷中細(xì)胞死亡的主要方式[8，9]。H9C2細(xì)胞系是大鼠胚胎心肌組織的亞克隆細(xì)胞株，可用于模擬心肌細(xì)胞的各種病理模型，在心肌保護(hù)的機(jī)制研究中發(fā)揮重要作用[10，11]。線粒體途徑在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，caspase-3是caspase家族中關(guān)鍵的效應(yīng)分子，其活性增加是線粒體凋亡發(fā)生的重要標(biāo)志[12，13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在H9C2心肌細(xì)胞H/R時(shí)，細(xì)胞皺縮，大量死亡，LDH釋放增多，caspase-3活性明顯增加，而Dex預(yù)處理后，可明顯減少細(xì)胞死亡和LDH釋放，抑制caspase-3活性。這些結(jié)果說(shuō)明，Dex可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡減輕H9C2心肌細(xì)胞H/R損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)，Dex預(yù)處理可明顯減少細(xì)胞凋亡從而減輕心肌缺血/再灌注損傷，然而Dex減少細(xì)胞凋亡是否依賴于線粒體，Dex減輕心肌缺血/再灌注損傷有無(wú)其它的作用靶點(diǎn)，相關(guān)的機(jī)制仍未闡明，具體信號(hào)分子有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究證實(shí)Dex可通過(guò)減少細(xì)胞凋亡在心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷中發(fā)揮重要保護(hù)作用，是一種潛在的缺血/再灌注心肌保護(hù)藥物。本研究為臨床上應(yīng)用Dex干預(yù)心血管疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但具體的信號(hào)機(jī)制有待深入的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Hausenloy DJ，Yellon DM.Myocardial ischemia-reperfusion injury：a neglected therapeutic target[J].J Clin Invest，2013，123（1）： 92-100.

[2]Hausenloy DJ，Yellon DM.Ischaemic conditioning and reperfusion injury[J].Nat Rev Cardiol，2016，13（4）：193-209.

[3]Morciano G，Giorgi C，Bonora M，et al.Molecular identity of the mitochondrial permeability transition pore and its role in ischemia-reperfusion injury[J].J Mol Cell Cardiol，2015（78）：142-153.

[4]姜翠翠，夏滿莉，王敏，等.右美托咪定預(yù)處理減輕離體大鼠心臟缺血/再灌注損傷的線粒體相關(guān)機(jī)制[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2013，42（3）：326-330.

[5]Guler L，Bozkirli F，Bedirli N，et al.Comparison of the effects of dexmedetomidine vs.Ketamin in cardiac ischemial reperfusion injury in rat-preliminary study[J].Adv Clin Exp Med，2014，23（5）：683-689.

[6]Devasya A，Sarpangala M.Dexmedetomidine：a review of a newer sedative in dentistry[J].J Clin Pediatr Dent，2015，39（5）：401-409.

[7]Terashima Y，Sato T，Yano T，et al.Roles of phospho-GSK-3β in myocardial protection afforded by activation of the mitochondrial K ATP channel[J].J Mol Cell Cardiol，2010，49（5）：762-770.

[8]Takemura G，Kanoh M，Minatoquchi S，et al.Cardiomyocyte apoptosis in the failing heart-a critical review from definition and classification of cell death[J].Int J Cardiol，2013，167（6）： 2373-2386.

[9]Zhang C，Huang Z，Gu J，et al.Fibroblast growth factor 21 protects the heart from apoptosis in a diabetic mouse model via extracellular signal-regulated kinase 1/2-dependent signalling pathway[J].Diabetologia，2015，58（8）：1937-1948.

[10]Wang X，Zhang Y，Wang H，et al.MicroRNA-145 aggravates hypoxia-induced injury by targeting Rac1 in H9c2 cells[J].Cell Physiol Biochem，2017，43（5）：1974-1986.

[11]Salani B，Ravera S，F(xiàn)abbi P，et al.Glibenclamide mimics metabolic effects of metformin in H9c2 cells[J].Cell Physiol Biochem，2017，43（3）：879-890.

[12]Major JL，Salih M，Tuana BS.E2F6 protein levels modulate drug induced apoptosis in cardiomyocytes[J].Cell Signal，2017（40）：230-238.

[13]Qian ZQ，Wang YW，Li YL，et al.Icariin prevents hypertension-induced cardiomyocyte apoptosis through the mitochondrial apoptotic pathway[J].Biomed Pharmacother，2017（88）：823-831.

收稿日期：2017-11-8；修回日期：2017-11-14

編輯/李樺