糖尿病腎臟疾病(DKD)是糖尿病(DM)的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，在每年新進(jìn)展至ESRD的患者中，DKD所占比例逐年升高。炎癥反應(yīng)是DKD發(fā)病的重要機(jī)制之一，而白細(xì)胞介素(IL-6)、單核趨化蛋白1(MCP-1)是DKD炎癥機(jī)制中的重要指標(biāo)[1]。Krüppel樣因子4(KLF4)又名胃腸富集KLF(gut-enriched Krüppel-like factor,GKLF)[2]，它可以調(diào)控IL-6[3]、MCP-1、iNOS[4]等因子表達(dá)，影響核因子κB(NF-κB)信號通路[5]，從而發(fā)揮抗炎或促炎作用。在腎臟炎癥方面，KLF4可調(diào)控HK-2細(xì)胞中MIF、MCP-1的表達(dá)[6]，但KLF4在腎小球系膜細(xì)胞中是否有表達(dá)，以及它對高糖刺激的腎小球系膜細(xì)胞炎癥是否同樣具有調(diào)控作用，尚未見報(bào)道。因此，本研究擬采用體外培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞模型，使用高糖刺激后，觀察KLF4及炎癥指標(biāo)IL-6、MCP-1的表達(dá)變化，從而探討DKD細(xì)胞模型中KLF4與炎癥反應(yīng)的關(guān)系。

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的一種修飾方式，它參與了體內(nèi)多項(xiàng)生理病理過程，而5-氮雜胞苷(5-Azacytidine，5-Az)，是最常用的甲基化抑制劑。在糖尿病腎病中，DNA甲基化水平明顯升高[7]，KLF4的表達(dá)水平與其轉(zhuǎn)錄子甲基化水平負(fù)相關(guān)，應(yīng)用5-Az后，KLF4表達(dá)水平升高[8,9]，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用5-Az后，可以上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)刺激的人HK-2細(xì)胞中KLF4表達(dá)[10]。因此，本研究中，我們擬采用5-Az抑制高糖刺激的腎小球系膜細(xì)胞的甲基化過程，觀察KLF4及炎癥指標(biāo)IL-6、MCP-1的變化，從而進(jìn)一步尋找KLF4調(diào)控DKD炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制。為探尋DKD的發(fā)病機(jī)制，尋找DKD的潛在治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料

小鼠腎小球系膜細(xì)胞(MES-13) 由ATCC提供。

主要儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：美國Applied Biosystems公司、Axygen、ABI；SDS PAGE凝膠電泳與轉(zhuǎn)膜設(shè)備、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)：Bio - Rad公司；核酸定量儀NanoDrop Lite、細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱：Thermo；凝膠成像系統(tǒng)5000 Plus：SAGECREATION。

主要試劑 羊抗兔IgG/HRP標(biāo)記、羊抗鼠IgG/HRP標(biāo)記：武漢博士德公司；Anti- KLF抗體：Abcam公司、proteintech公司；5-氮雜胞嘧啶核苷：Sigma；Anti-IL-6抗體、Anti-MCP-1抗體：Proteintech公司；Anti-GAPDH抗體：南京凱基公司；KLF4 引物、GAPDH 引物、IL-6 引物、MCP-1 引物：GeneCopoeia公司；mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：Thermo；KOD -Plus- Neo：TOYOBO；QIAprep Spin Miniprep Kit：QIAGEN；Positive clone測序：生工生物工程(上海)有限公司。

實(shí)驗(yàn)方法

細(xì)胞培養(yǎng) 將MES-13細(xì)胞株復(fù)蘇后，用含低糖(5.5 mmol/L D-葡萄糖)DMEM的25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶在恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)，按1∶ 2～1∶ 4比例傳代。

細(xì)胞分組

高糖處理不同時(shí)間點(diǎn)的MES-13細(xì)胞實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞接種于六孔培養(yǎng)板或60 mm培養(yǎng)皿，使用低糖DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至融合程度約70%～80%后，更換細(xì)胞培養(yǎng)基為高糖(30 mmol/L D-葡萄糖)DMEM完全培養(yǎng)基，分別于0h，6h，12h，24h，36h，48h，72h提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，使用WB測KLF4蛋白表達(dá)，選取最佳刺激時(shí)間。

不同濃度5-Az干預(yù)高糖處理48h的MES-13細(xì)胞實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞接種于六孔培養(yǎng)板或60 mm培養(yǎng)皿，使用低糖DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至融合程度約70%～80%后，更換細(xì)胞培養(yǎng)基，將實(shí)驗(yàn)分為低糖組，高滲組(30 mmol/L甘露醇)，高糖+不同濃度5-Az組(0.5 μmol/L，1 μmol/L,2 μmol/L,5 μmol/L)。培養(yǎng)48h，分別提取各組細(xì)胞總蛋白，使用Westen Blot檢測各組KLF4、IL-6、MCP-1蛋白的表達(dá)，選取5-Az最佳干預(yù)濃度。

5-Az(5 μmol/L)干預(yù)高糖處理48h的MES-13細(xì)胞實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞接種于六孔培養(yǎng)板或60 mm培養(yǎng)皿，以低糖DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至融合程度約70%～80%后更換細(xì)胞培養(yǎng)基，將實(shí)驗(yàn)分為低糖組、高滲組、高糖組，高糖+5-Az(5 μmol/L)組。培養(yǎng)48h分別提取各組細(xì)胞總RNA，使用Real-Time PCR檢測KLF4、IL-6、MCP-1 mRNA表達(dá)。

慢病毒轉(zhuǎn)染KLF4基因至MES-13細(xì)胞的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入MES-13細(xì)胞中，細(xì)胞分為空白質(zhì)粒組(Lv-NC)和KLF4基因組(Lv-KLF4)，細(xì)胞接種于六孔培養(yǎng)板或60 mm培養(yǎng)皿，以低糖DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至融合程度約70%～80%后，更換細(xì)胞培養(yǎng)基為高糖DMEM完全培養(yǎng)基，0h、48h時(shí)分別提取各組細(xì)胞總RNA，使用Real-Time PCR檢測KLF4、IL-6、MCP-1 mRNA表達(dá)。

Western Blot 將各組MES-13細(xì)胞從細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中取出，棄舊完全培養(yǎng)基，用PBS溶液沖洗3次后，加入適量RIPA裂解液(強(qiáng))及PMSF裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞裂解液離心，留取上清液，測定目標(biāo)樣品蛋白濃度。將待測蛋白樣品按每孔20～50 μg上樣，然后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜。封閉2h后，洗去封閉液，根據(jù)目的蛋白分子量，將PVDF膜裁成若干條帶狀小膜，將裁剪的PVDF膜分別放入已配好的含有不同目的蛋白一抗稀釋液(KLF4、IL-6、MCP-1、GAPDH)的離心管中，4℃搖床上孵育過夜。洗脫一抗后，根據(jù)目的蛋白種屬來源，使用目的蛋白抗體種屬相對應(yīng)的二抗孵育液孵育1～2h。洗脫二抗，加入ECL工作液至化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中進(jìn)行顯影。使用成像分析系統(tǒng)掃描分析發(fā)光結(jié)果，應(yīng)用圖像分析軟件Image J進(jìn)行目的蛋白和內(nèi)參GAPDH吸光度分析。

Real-Time PCR 在GeneBank網(wǎng)站中查找小鼠KLF4、IL-6、MCP-1的基因序列，從GeneCopoeia訂購KLF4、IL-6、MCP-1、GAPDH引物。KLF4引物：forward 5′-GAATTCATGAGGCAGCCACCTGGC-3′,reverse 5′-GGATCCTTAAAAATGCCTCTTCATGTG-3′;IL-6引物：forward 5′-CTGGGTACCGGATCCTGAGAGTGTGTTTT-3′,reverse 5’-GCAAGCTTGGAACTTCATAGCGGTTTCT-3’;MCP-1引物：forward 5′-CAGGTCTCTGTCACGCTTCT-3′,reverse 5′-AGTATTCATGGAAGGGAATAG-3′;GAPDH引物：forward 5′-ATCACTGCCACCCAGAAGACT-3′,reverse 5′-CATGCCAGTGAGCTTCCCGTT-3′。嚴(yán)格按北京全式金生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA、測定總RNA濃度、合成cDNA、PCR擴(kuò)增。

構(gòu)建KLF4過表達(dá)質(zhì)粒 根據(jù)KLF4基因引物序列：forward 5′-GAATTCATGAGGCAGCCACCTGGC-3′;reverse 5′-GGATCCTTAAAAATGCCTCTTCATGTG-3′合成KLF4-CDS序列。按QIAGEN質(zhì)粒小抽說明書提取質(zhì)粒，測定載體片段的濃度。將目的片段進(jìn)行擴(kuò)增及酶切后，測定目的片段的濃度。按載體：目的片段=1∶ 7的摩爾比例計(jì)算載體和目的片段所需的體積比，于22℃連接60 min。取10 μl連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞中于冰上(4℃)放置30 min，之后于42℃水浴中熱擊90 S，再迅速置于冰上(4℃)放置2～3 min。加入500 μl不含抗生素的SOC培養(yǎng)基于37 ℃,225 r/min振蕩培養(yǎng)45 min。離心后棄上清液，將管底的菌液吹打散開，加入到含有載體上對應(yīng)抗性(氨芐或卡那等)的培養(yǎng)平板中，用滅菌的涂布器涂勻倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)。挑取若干個(gè)單菌落，進(jìn)行小量搖菌培養(yǎng)，送測序公司進(jìn)行測序鑒定。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析研究結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用GraphPad Prism5作圖并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。統(tǒng)計(jì)方法為每兩組之間的單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

高糖處理不同時(shí)間點(diǎn)的MES-13細(xì)胞中KLF4蛋白表達(dá)KLF4蛋白在MES-13細(xì)胞中有表達(dá)。高糖處理組與未經(jīng)過高糖處理組(0h)相比，KLF4蛋白表達(dá)水平于高糖處理24h時(shí)出現(xiàn)下調(diào)(P<0.05)，于高糖處理36h、48h、72h時(shí)，出現(xiàn)明顯下調(diào)(P<0.01)(圖1)。因高糖處理48h后，KLF4蛋白表達(dá)下降明顯，故在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，選擇48h為高糖刺激時(shí)間。

圖1 高糖處理不同時(shí)間點(diǎn)的MES-13細(xì)胞中KLF4蛋白表達(dá)

不同濃度5-Az對高糖處理MES-13細(xì)胞中KLF4、IL-6、MCP-1蛋白表達(dá)的影響高滲組與低糖組相比，KLF4、IL-6蛋白表達(dá)無明顯差異，MCP-1蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.001)。高糖組與低糖組相比，KLF4蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)明顯下調(diào)(P<0.001)，IL-6蛋白(P<0.01)、MCP-1蛋白(P<0.001)表達(dá)水平明顯上調(diào)。高糖+5-Az組與高糖組相比，5-Az濃度為0.5 μmol/L、1 μmol/L時(shí)，KLF4蛋白表達(dá)雖有上調(diào)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，5-Az濃度為2 μmol/L、5 μmol/L時(shí)，KLF4蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01)。5-Az濃度為0.5 μmol/L時(shí)，IL-6蛋白表達(dá)即有下調(diào)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同5-Az濃度(1 μmol/L、2 μmol/L，5 μmol/L)時(shí)，IL-6蛋白表達(dá)均有明顯下調(diào)(P<0.001)。不同5-Az濃度(0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L)時(shí)，MCP-1蛋白表達(dá)均有明顯下調(diào)(P<0.001)(圖2)。從以上結(jié)果中可見，當(dāng)5-Az濃度為5 μmol/L時(shí)，5-Az對KLF4、IL-6、MCP-1蛋白表達(dá)均有明顯影響，故我們選擇5 μmol/L作為5-Az的干預(yù)濃度。

圖2 不同濃度5-Az對高糖處理48h的MES-13細(xì)胞中KLF4、IL-6、MCP-1蛋白表達(dá)的影響

KLF4、IL-6、MCP-1基因在MES-13細(xì)胞的表達(dá)Lv-KLF4組與Lv-NC組相比，KLF4 mRNA表達(dá)明顯增加，IL-6、MCP-1 mRNA表達(dá)無明顯變化。Lv-NC(hi)組與Lv-NC組相比，KLF4 mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)，IL-6、MCP-1 mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)。Lv-KLF4(hi)組與Lv-NC(hi)組相比，KLF4 mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，IL-6、MCP-1 mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)(圖3)。

圖3 KLF4、IL-6、MCP-1基因在MES-13細(xì)胞的表達(dá)

5-Az對高糖處理的MES-13細(xì)胞KLF4、IL-6、MCP-1 mRNA表達(dá)的影響高滲組與低糖組相比，KLF4 mRNA表達(dá)水平無明顯變化，IL-6、MCP-1 mRNA表達(dá)水平均稍有上調(diào)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。高糖組與低糖組相比，KLF4 mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.01)，IL-6 mRNA(P<0.01)、MCP-1 mRNA(P<0.001)表達(dá)水平明顯上調(diào)，而高糖+5-Az(5 μmol/L)組與高糖組相比，KLF4 mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.001)，IL-6 mRNA(P<0.05)、MCP-1 mRNA(P<0.01)表達(dá)水平明顯下調(diào)(圖4)。

圖4 5-Az(5 μmol/L)對高糖處理48h的MES-13細(xì)胞中KLF4、IL-6、MCP-1 mRNA表達(dá)的影響

討 論

DKD是DM常見的微血管病變，已成為ESRD的主要原發(fā)病之一[11]。DKD的發(fā)病是多因素共同作用的結(jié)果，其中炎癥反應(yīng)越來越被人關(guān)注。在高血糖、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活等病理狀態(tài)下，腎臟中可出現(xiàn)大量單核/巨噬細(xì)胞的浸潤，且浸潤的炎性細(xì)胞和腎臟固有細(xì)胞都可產(chǎn)生釋放多種炎性因子，如MCP-1、IL-6等，這些炎癥因子能通過自分泌、旁分泌的方式，放大炎癥反應(yīng)，最終可引起腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化。

KLF4羧基端有高度保守的DNA結(jié)合域，氨基端含高度變異的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)域，因此可通過與其他因子相互作用，決定KLF4轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性[12]。KLF4在組織器官中有重要生理功能，參與了許多重要的病理過程，如炎癥調(diào)控、腎纖維化等[13-14]。KLF4能抑制IL-6、IL-1β、IL-10啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)IL-6、IL-1β表達(dá)，上調(diào)IL-10表達(dá)[3,10,18]，還可以調(diào)節(jié)NF-κB炎性反應(yīng)通路，改善結(jié)腸[15]、心肌組織[10]和血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥[16]。KLF4還可調(diào)控巨噬細(xì)胞標(biāo)記蛋白表達(dá)，影響巨噬細(xì)胞極化[4,17]、促進(jìn)骨髓來源的抑制性細(xì)胞(MDSCs)聚集，發(fā)揮抗炎作用[19]。然而，KLF4也可使動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化[21]，可活化如TNF-α、 IL-1α等促炎因子，可與Smad的共激活物p300/CBP相互作用，誘導(dǎo)iNOS生成，發(fā)揮促炎作用[20,22]?？傊?，在調(diào)控炎癥方面，KLF4在不同組織和細(xì)胞中，發(fā)揮抗炎或促炎的作用，其調(diào)控炎癥反應(yīng)的機(jī)制存有差異。

KLF4在哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛表達(dá)，但在腎小球系膜細(xì)胞中是否表達(dá)仍不清楚，而DKD作為一種以炎癥反應(yīng)為主要特征之一的疾病，KLF4在DKD中的表達(dá)情況仍未見報(bào)道。因此，在本研究中，我們采用高糖刺激腎小球系膜細(xì)胞(MES-13細(xì)胞)建立糖尿病體外模型，明確KLF4在腎小球系膜細(xì)胞中的表達(dá)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KLF4蛋白在MES-13細(xì)胞中存在表達(dá)。而且在高糖處理MES-13細(xì)胞不同時(shí)間后，KLF4蛋白于高糖處理24h開始下調(diào)，于高糖處理36h、48h、72h時(shí)，出現(xiàn)明顯下調(diào)。由此可見，KLF4蛋白可能參與了DKD的發(fā)生發(fā)展過程。

Mreich等[6]的研究表明，在高糖刺激的人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)及小鼠DKD模型中，KLF4表達(dá)明顯下調(diào)。而在HK-2細(xì)胞纖維化模型中，KLF4可降低TGF-β1干預(yù)誘導(dǎo)的炎性蛋白MIF、MCP-1表達(dá)上調(diào)，提示KLF4可抑制HK-2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。但KLF4對高糖處理的腎小球系膜細(xì)胞炎癥的調(diào)控尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。為探討DKD中KLF4對炎癥調(diào)控的機(jī)制，我們在高糖處理MES-13細(xì)胞后，觀察KLF4和炎癥指標(biāo)IL-6、MCP-1的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，高糖(30 mmol/L)處理MES-13細(xì)胞48h后，與低糖組及高滲對照組相比，KLF4的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，而IL-6、MCP-1的mRNA和蛋白表達(dá)則顯著上調(diào)。這提示在糖尿病腎病發(fā)病過程中，存在明顯炎癥反應(yīng)，這與之前的報(bào)道相符合[23-24]，而KLF4可能參與了IL-6、MCP-1表達(dá)的調(diào)控。為證實(shí)這一設(shè)想，我們將KLF4基因通過慢病毒轉(zhuǎn)染至MES-13細(xì)胞中，在高糖刺激0h、48h時(shí)，分別檢測KLF4、IL-6、MCP-1 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果提示：在高糖刺激0h的MES-13細(xì)胞中，KLF4質(zhì)粒組與空白質(zhì)粒組相比，KLF4 mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，而IL-6、MCP-1 mRNA表達(dá)水平無明顯變化。高糖刺激細(xì)胞48h后，在空白質(zhì)粒組細(xì)胞中，KLF4 mRNA表達(dá)水平下調(diào)，而IL-6、MCP-1 mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，而KLF4質(zhì)粒組與空白質(zhì)粒組相比，KLF4 mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，而IL-6、MCP-1 mRNA表達(dá)水平出現(xiàn)明顯下降。這說明在高糖刺激的MES-13細(xì)胞中，KLF4可抑制IL-6、MCP-1的表達(dá)而減輕細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

表觀遺傳學(xué)可在不改變DNA序列的前提下，調(diào)節(jié)基因或蛋白的表達(dá)。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分。DNA甲基化在蛋白尿、炎癥反應(yīng)、EMT等多種病理過程中均發(fā)揮了重要的作用。甲基化抑制劑5-Az可降低DNA甲基化水平被廣泛應(yīng)用于腫瘤、EMT的研究。宮頸癌組織較正常宮頸組織相比，KLF4 mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)，且其表達(dá)與啟動(dòng)子甲基化表現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)。應(yīng)用5-Az后，KLF4的mRNA和蛋白質(zhì)在宮頸癌細(xì)胞中的含量明顯增加[8]。同樣有研究發(fā)現(xiàn)[9]，5-Az可減少DNMT-1的表達(dá)，從而恢復(fù)KLF4在套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系中的表達(dá)。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)[10]，在TGF-β1刺激的人HK-2細(xì)胞中，5-Az可抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1導(dǎo)致的KLF4啟動(dòng)子過甲基化，上調(diào)KLF4的表達(dá)水平，減輕人HK-2細(xì)胞上皮EMT過程。同時(shí)Zhang等[7]在DKD模型中發(fā)現(xiàn)，DNMT-1、核因子Sp1、NF-κB-p65因子的表達(dá)水平顯著增加。5-Aza可抑制Sp1/NF-κB p65-DNMT1通路，減輕糖尿病小鼠的蛋白尿。因此，我們推測KLF4在高糖處理的MES-13細(xì)胞中表達(dá)降低，與KLF4啟動(dòng)子過甲基化有關(guān)。故為探討糖尿病腎病中KLF4對炎癥調(diào)控的機(jī)制，我們應(yīng)用不同濃度的5-Az，抑制DNA甲基化過程，觀察其對KLF4和炎癥因子IL-6、MCP-1表達(dá)的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖+5-Az組與高糖組相比，5-Az濃度為2 μmol/L、5 μmol/L時(shí)，KLF4蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)。相反，IL-6蛋白表達(dá)在5-Az濃度為1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L時(shí)，出現(xiàn)顯著下調(diào)。MCP-1蛋白表達(dá)則在5-Az濃度0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L時(shí)，均有明顯下調(diào)。進(jìn)一步用qPCR方法檢測KLF4、IL-6、MCP-1的mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，高糖+5-Az干預(yù)組與高糖處理組相比，KLF4 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，IL-6、MCP-1 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)。這些結(jié)果提示，5-AZ可上調(diào)高糖處理的MES-13細(xì)胞中的KLF4表達(dá)，減少IL-6、MCP-1表達(dá)。由此可見，使用5-Az抑制DNA甲基化過程后，在KLF4蛋白上調(diào)的同時(shí)，腎小球系膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)明顯減輕，提示糖尿病腎病發(fā)病過程中，KLF4表達(dá)下調(diào)很可能與DNA甲基化有關(guān)，而抑制DNA甲基化后，可使KLF4表達(dá)上調(diào)，炎癥反應(yīng)減輕。但KLF4啟動(dòng)子區(qū)域是否發(fā)生DNA甲基化，仍需后續(xù)研究進(jìn)一步驗(yàn)證，如KLF4啟動(dòng)子甲基化水平檢測。

綜上所述，本研究通過高糖刺激腎小球系膜細(xì)胞建立體外DKD模型，觀察高糖刺激后MES-13細(xì)胞中KLF4、IL-6、MCP-1的表達(dá)，提示KLF4蛋白可能參與了DKD的發(fā)生發(fā)展過程。而采用甲基化抑制劑5-Az干預(yù)后，可恢復(fù)KLF4 mRNA和蛋白表達(dá)，減輕IL-6和MCP-1 蛋白及mRNA上調(diào)的程度，表明KLF4蛋白表達(dá)的恢復(fù)可減輕DKD的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與KLF4啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化相關(guān)。本研究為探討DKD的發(fā)病機(jī)制及尋找新的治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。