孟磊，龐月

(1.盤(pán)錦職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧 盤(pán)錦 124000；2.葫蘆島市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，遼寧 葫蘆島 125000)

阿爾茨海默癥(alzheimer’s disease，AD)是一種以記憶功能減退為主要標(biāo)志的神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，主要包括β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)的沉積、tau 蛋白的過(guò)度磷酸化、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)元丟失等[1-2]。據(jù)2016年報(bào)道顯示，全球AD患者已超過(guò)5 000萬(wàn)，預(yù)計(jì)到2050年，全世界AD患者將超過(guò)1億3 000萬(wàn)。目前臨床上用于治療AD的藥物是乙酰膽堿抑制劑和N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑，但療效不盡如人意，且存在著一定的副作用[3]。對(duì)于多因素引起的疾病，例如AD，針對(duì)單一靶點(diǎn)的治療很難達(dá)到治療預(yù)期。研究者已把尋找單一靶點(diǎn)藥物的治療思路轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟悬c(diǎn)、多通路治療的思路。中藥作為天然藥物，其多成分具有多靶點(diǎn)的治療機(jī)制，且天然藥物逐漸被FDA所接受[4]。因此，從中藥中尋找治療AD的藥物，并闡明其物質(zhì)基礎(chǔ)及分子作用機(jī)制越來(lái)越受到研究者的廣泛重視和關(guān)注。

據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版一部記載，遠(yuǎn)志(Polygalae Radix)為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志PolygalatenuifoliaWilld或卵葉遠(yuǎn)志PolygalatenuifoliaWilld的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是常用于治療情志類(lèi)疾病的中藥，其性溫，味苦、辛，歸心、腎、脾經(jīng)，具安神益智、交通心腎、祛痰、消腫等功效[5]。現(xiàn)代藥理作用研究發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)志具有抗氧化、保護(hù)神經(jīng)元、改善學(xué)習(xí)記憶及保護(hù)心腦血管等疾病的功效；而研究表明，氧化應(yīng)激、神經(jīng)元丟失、學(xué)習(xí)記憶功能丟失都是阿爾茨海默癥的病因[6]。因此，本研究運(yùn)用行為學(xué)和生化指標(biāo)集中于研究遠(yuǎn)志的抗AD的藥效物質(zhì)及其可能的作用相關(guān)機(jī)制，為其今后的開(kāi)發(fā)利用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

UV759S型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，JA5003十萬(wàn)分之一分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)。BSA124S電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，ZDHW調(diào)溫電熱套(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，KQ-200KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，HH-4型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)，F(xiàn)W100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)，標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩(浙江上虞銀河測(cè)儀器廠)，倒置顯微鏡(Nikon，日本)，流式細(xì)胞儀(BD，美國(guó))，Morris水迷宮，Y迷宮(北京智多寶科技有限公司)。

遠(yuǎn)志購(gòu)自于北京同仁堂，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志PolygalatenuifoliaWilld的干燥根，蘆丁、去羥基遠(yuǎn)志皂苷元(購(gòu)自于大連美侖生物科技有限公司)，純度≥98%，D101大孔吸附樹(shù)脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)，無(wú)水乙醇、雙氧水、95%乙醇(山東禹王集團(tuán))，NaNO2、Al(NO3)3、NaOH(天津富宇精密化工有限公司)，所有試劑均為分析純。

昆明種SPF級(jí)雄性小鼠84只，體重18～22 g，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。許可證號(hào)：SCXK(川2015-29)。

2 方 法

2.1 遠(yuǎn)志總黃酮的含量測(cè)定

分析天平稱(chēng)取干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10.0 mL于50 mL棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并定容至刻度線，得到0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。移液管精密移取0、1、2、3、4、5、6 mL于25 mL容量瓶中，分別補(bǔ)加蒸餾水使體積均為6 mL，加入5%NaNO2溶液1 mL，混勻，放置6 min，加入10%Al(NO3)31 mL，混勻，放置6 min，加入4%NaOH溶液10 mL后再加蒸餾水至刻度線，定容，放置15 min后在510 nm紫外分光光計(jì)下測(cè)定其吸光值，以蘆丁的含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]。得標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=6.411 6 C + 0.040 5，R2= 0.999 1。

2.2 遠(yuǎn)志總皂苷的含量測(cè)定

稱(chēng)取去羥基遠(yuǎn)志皂苷元11.56 mg于20 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度線，定容，即得0.578 mg/L去羥基遠(yuǎn)志皂苷元標(biāo)準(zhǔn)溶液。移取0、20、40、60、80、100 μL于6支具塞磨口中，水浴加熱揮去甲醇后加入1.0 mL 5%香蘭素試劑、4.0 mL高氯酸，密塞，搖勻，于60 ℃恒溫水浴中加熱15 min后取出冷卻至室溫，于560 nm處測(cè)定吸收度，以去羥基遠(yuǎn)志皂苷元濃度為橫坐標(biāo)，吸收度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.017 5 C - 0.008 2，R2= 0.999 6。

2.3 遠(yuǎn)志總皂苷粗提物的制備

2.5 kg遠(yuǎn)志加6倍量的85%乙醇提取液回流提取3次，每次2 h，濾過(guò)，合并濾液，減壓蒸干，得遠(yuǎn)志總提物浸膏530 g，備用。加1倍量水溶解，用水飽和的醋酸乙酯提取3次，棄去醋酸乙酯層，合并水層，減壓蒸干，得遠(yuǎn)志總皂苷粗提物310 g，備用。

2.4 大孔樹(shù)脂預(yù)處理

稱(chēng)取10倍量的D101大孔吸附樹(shù)脂于燒杯中，加入95%乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹活化，裝柱，加入95%洗脫至流出液無(wú)渾濁，再用純凈水洗脫至無(wú)醇味，備用。

2.5 遠(yuǎn)志總皂苷的富集

將得到的遠(yuǎn)志總皂苷粗提物用熱水分散，裝柱，依次用蒸餾水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇進(jìn)行洗脫，每個(gè)梯度4 BV，合并相同梯度洗脫液，減壓蒸干，得各個(gè)餾分65、56、79、36、32、16 g，備用。

2.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

將84只KM小鼠隨機(jī)分為7組，每組12只，分別是對(duì)照組、模型組、給藥組(10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇洗脫餾分)150 mg/kg，給予模型組、給藥組小鼠按2 mg/kg皮下注射東莨菪堿，連續(xù)7 d，建立小鼠記憶障礙模型。并在每天早晨8:30灌胃給藥，連續(xù)給予10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇洗脫餾分21 d，對(duì)照組、模型組給予等體積的生理鹽水，最后一次給藥后，進(jìn)行Morris水迷宮、Y迷宮實(shí)驗(yàn)，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)試后，將小鼠脫頸處死，取其海馬和皮質(zhì)，稱(chēng)其重量-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.7 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

將水迷宮分為均等的4個(gè)象限，分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限，小鼠入水點(diǎn)為4個(gè)象限貼壁的正中部位，并將平臺(tái)放置于Ⅰ象限水平面以下1 cm，水溫為(20±2) ℃。此次實(shí)驗(yàn)由兩部分實(shí)驗(yàn)組成，分別是定位巡航實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)步驟：(1)定位巡航實(shí)驗(yàn)，這是一個(gè)學(xué)習(xí)記憶的過(guò)程，為5 d，將小鼠分別從4個(gè)象限面壁放入水中，由視頻系統(tǒng)記錄其找到平臺(tái)的所需時(shí)間，即為逃避潛伏期。小鼠找到平臺(tái)并在平臺(tái)上停留10 s，則其學(xué)習(xí)停止；若小鼠在120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則將其放至平臺(tái)上10 s，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后記錄其逃避潛伏期為120 s；(2)空間探索實(shí)驗(yàn)：在水迷宮第6 天，將平臺(tái)撤去，讓大鼠在無(wú)平臺(tái)的情況在迷宮游泳120 s，記錄其跨越原平臺(tái)次數(shù)。

2.8 Y迷宮測(cè)試

在本實(shí)驗(yàn)中的Y迷宮實(shí)驗(yàn)，由3個(gè)(A、B、C)等長(zhǎng)、互成120。的臂組成的，每臂長(zhǎng)寬高45 cm × 14 cm × 15 cm，臂中間有透明有機(jī)玻璃蓋，將小鼠放入一臂的末端(A臂)，作為起始臂，記錄8 min內(nèi)小鼠進(jìn)臂總數(shù)和連續(xù)3次進(jìn)入不同臂的次數(shù)，即ABC、ACB、BCA、BAC、CAB、CBA。計(jì)算其自發(fā)交替率，計(jì)算公式為：自發(fā)交替率 = 連續(xù)3次進(jìn)入不同臂的次數(shù)/(進(jìn)臂總數(shù)-2)× 100%。

2.9 ROS、MDA、SOD、CAT、GSH-Px的含量測(cè)定

將海馬和皮質(zhì)按重量加入5倍量的生理鹽水，超聲破碎后離心，吸取上清液150 μL按ROS、 MDA、SOD、CAT、GSH-Px試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，于530、530、550、240、412 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值并計(jì)算其含量。

2.10 采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用±S表示，采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 不同洗脫餾分黃酮含量測(cè)定

按“2.1”條件下，對(duì)各個(gè)富集的洗脫餾分進(jìn)行黃酮含量測(cè)定，測(cè)定結(jié)果顯示30%洗脫餾分的黃酮含量最高，50%次之，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同洗脫餾分黃酮含量的測(cè)定結(jié)果

3.2 不同洗脫餾分遠(yuǎn)志總皂苷含量測(cè)定

按“2.2”條件下，對(duì)各個(gè)富集的洗脫餾分進(jìn)行遠(yuǎn)志總皂苷含量測(cè)定，測(cè)定結(jié)果顯示70%洗脫餾分的遠(yuǎn)志總皂苷含量最高，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同洗脫餾分遠(yuǎn)志總皂苷含量的測(cè)定結(jié)果

3.3 Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果

如圖1A所示，50%和70%洗脫餾分給藥小鼠在學(xué)習(xí)的第4天時(shí)，與模型組相比，逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05，P<0.05)，而在學(xué)習(xí)的第5 天，50%和70%洗脫餾分給藥小鼠的逃避潛伏期也會(huì)明顯縮短(P<0.05，P<0.01)，而其它給藥小鼠的逃避潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。如圖1B在探索實(shí)驗(yàn)中，與模型組相比，50%和70%洗脫餾分給藥小鼠穿過(guò)平臺(tái)的次數(shù)明顯增多(P<0.05，P<0.01)。

3.4 Y迷宮測(cè)試結(jié)果

如圖2A所示，所有小鼠在測(cè)試8 min內(nèi)進(jìn)入臂的總數(shù)均無(wú)顯著性差異，這表明東莨菪堿和不同洗脫餾分給藥組對(duì)小鼠的自主活動(dòng)均沒(méi)有影響。圖2B顯示與對(duì)照組相比，模型組的自發(fā)交替率明顯降低(P<0.01)，而50%，70%洗脫餾分會(huì)明顯增加小鼠的自發(fā)交替率(P<0.05，P<0.01)，其它給藥組對(duì)模型小鼠的自發(fā)交替率無(wú)影響。

**P<0.01，***P<0.001 vs 對(duì)照組;#P<0.05，##P<0.01 vs 模型組

圖1 不同洗脫餾分對(duì)東莨菪堿誘導(dǎo)的記憶障礙模型小鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=12)

**P<0.01vs 對(duì)照組;#P<0.05，##P<0.01vs模型組

圖2 不同洗脫餾分對(duì)東莨菪堿誘導(dǎo)的記憶障礙模型小鼠在Y迷宮實(shí)驗(yàn)中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=12)

3.5 不同餾分對(duì)東莨菪堿誘導(dǎo)記憶障礙小鼠模型中ROS、MDA、SOD、CAT、GSH-Px的影響

如表5所示，與正常組相比，模型組中的海馬和皮質(zhì)中的ROS、MDA會(huì)顯著性升高(P<0.01)，而抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的活性則會(huì)降低(P<0.01)，50%、70%洗脫餾分給藥組均能降低海馬和皮質(zhì)中的ROS、MDA的水平，但50%洗脫餾分降低得更多(P<0.01，P<0.05)，50%、70%洗脫餾分給藥組也能增加海馬和皮質(zhì)中抗氧化酶SOD(P<0.01)、CAT(P<0.01)、GSH-Px(P<0.05)的活性，而其它洗脫餾分的給藥組則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 討 論

遠(yuǎn)志主要含有皂苷類(lèi)、山酮類(lèi)、寡糖酯類(lèi)、生物堿類(lèi)、多糖類(lèi)、黃酮類(lèi)等化合物，遠(yuǎn)志中的皂苷類(lèi)成分已經(jīng)被證實(shí)具有抗老年癡呆活性[8]，而黃酮類(lèi)化合物是一種廣泛存在于花果蔬菜中的一類(lèi)化合物，具有抗炎、清除自由基、治療心血管系統(tǒng)疾病作用等生理活性[9]。遠(yuǎn)志中的皂苷類(lèi)化合物大多為齊墩果烷型三萜皂苷，已有研究報(bào)道遠(yuǎn)志中有近百種遠(yuǎn)志皂苷，但其化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，遇酸極易水解[10]。國(guó)內(nèi)外對(duì)遠(yuǎn)志的皂苷類(lèi)成分的研究比較常見(jiàn)，大部分研究都是集中在采用不同類(lèi)型的大孔吸附樹(shù)脂對(duì)其皂苷類(lèi)成分進(jìn)行富集并進(jìn)行含量的測(cè)定，且能得到較好的結(jié)果。但富集的皂苷類(lèi)成分還含有一些其它類(lèi)成分，且沒(méi)有進(jìn)行成分的測(cè)定。在本研究中，對(duì)富集后的總皂苷類(lèi)的成分進(jìn)行了黃酮類(lèi)化合物的測(cè)定，且黃酮類(lèi)化合物具有較好的抗老年癡呆活性，以區(qū)分其藥效成分。

目前，臨床上對(duì)于AD的治療的藥物主要是通過(guò)改善膽堿能系統(tǒng)功能來(lái)達(dá)到緩解AD的目的，但不能根治AD?，F(xiàn)代研究表明，遠(yuǎn)志類(lèi)的化學(xué)成分能抑制AD模型大鼠腦組織中的膽堿酯酶的活性，通過(guò)改善其膽堿能功能，改善AD模型小鼠或大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，從而達(dá)到治療AD的目的[11]。但一直以來(lái)都未對(duì)其化學(xué)成分的類(lèi)型進(jìn)行分析。此外，遠(yuǎn)志也能改善D-半乳糖并聯(lián)合使用ApoE4 雙側(cè)注射海馬AD模型大鼠的大腦皮質(zhì)及海馬乙酰膽堿脂酶活力，提高腦組織中的乙酰膽堿水平[12]。

在正常生理?xiàng)l件下，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基與機(jī)體內(nèi)抗氧化酶清除自由基系統(tǒng)是平衡的，但當(dāng)這種系統(tǒng)被破壞時(shí)，主要是機(jī)體內(nèi)的抗氧酶活力降低時(shí)，體內(nèi)的自由基水平就會(huì)增多，產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，氧化應(yīng)激是造成神經(jīng)細(xì)胞損傷，這是引起許多神經(jīng)退行性疾病的重要發(fā)病機(jī)制，如阿爾茨海默癥(AD)、帕金森病(PD)等。氧化應(yīng)激還會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA的水平增加，引起細(xì)胞損傷，使得機(jī)體快速進(jìn)入衰老狀態(tài)[13]。因此，清除自由基是延緩衰老的重要方法。本研究結(jié)果表明，遠(yuǎn)志黃酮及皂苷類(lèi)成分不論在動(dòng)物小鼠模型中能降低ROS和MDA的含量，清除多余的自由基，減少脂質(zhì)過(guò)氧化；增加清除自由基酶SOD、CAT、GSH-Px的活力，增強(qiáng)機(jī)體自身清除自由基的能力，減少過(guò)氧化損傷，從而達(dá)到保護(hù)機(jī)體的目的。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志中皂苷類(lèi)和黃酮類(lèi)成分具有神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)東莨菪堿誘導(dǎo)的記憶障礙模型有神經(jīng)保護(hù)作用，連續(xù)給藥21 d后，會(huì)降低小鼠海馬和皮質(zhì)中的ROS和MDA的含量，同樣地會(huì)增加抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的活力。以上結(jié)果充分說(shuō)明了遠(yuǎn)志中的皂苷類(lèi)和黃酮類(lèi)成分具有神經(jīng)保護(hù)的作用，在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，將進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)深入地來(lái)探討其在神經(jīng)保護(hù)方面的活性及其探究發(fā)揮療效的可能物質(zhì)。