才志陽，趙楠，郭偉英

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥品管理科；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院；3.錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，遼寧 錦州 121000)

葎草(humulus scandens)為桑科植物葎草的全草，又名勒草、老虎藤。最早見于《唐本草》。植株分布于除新疆、青海以外的大部分地區(qū)。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為其具有清熱解毒，退熱除蒸，利尿通淋等方面的功效[1-2]。藥用成分主要是葎草總黃酮，包含木樨草素、牡荊素等成分。經(jīng)過藥理學(xué)研究[3-5]，發(fā)現(xiàn)葎草總黃酮對于潰瘍性結(jié)腸炎具有明顯的抑制作用。

本實驗以前期藥理學(xué)實驗[6]為基礎(chǔ)，進一步探討葎草總黃酮在體內(nèi)的代謝情況，建立葎草總黃酮體內(nèi)檢測的高效液相色譜方法，為下一步研究其分子生物學(xué)相關(guān)機制提供可靠的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

賽里多斯pH儀(北京賽利多斯)；Agilent1100(G1314A)高效液相色譜系統(tǒng)(美國Agilent公司)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮)；Milli-Q Synthesis制水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；AL204電子天平(上海梅特勒-托利多儀器)；TGL-16臺式高速離心機(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.2 試藥

葎草總黃酮結(jié)腸定位膠囊(錦州醫(yī)科大學(xué)藥物分析教研室制備，經(jīng)HPLC法測定含有木樨草素1.52 mg/g，牡荊素0.32 mg/g)，木樨草素(sigma，批號62696)牡荊素(111K1520)，甲醇(天津富宇化工)，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 實驗動物

錦州醫(yī)科大學(xué)SD大鼠(動物生產(chǎn)合格證號：SCXK(遼)-2003007)，體重(245±15)g，雌雄各半。試驗前禁食12 h自由飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Diamonsil ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)進行分析。VWD型檢測器，流動相：甲醇-20 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液(58∶42，pH=4.0)，流速為1.0 mL/min。進樣量：20 μL，檢測波長在350 nm，柱溫30 ℃。水為超純水。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備 分別精密稱取60 ℃減壓干燥8 h的木樨草素與牡荊素對照品適量，置于同一25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋制成濃度為232.0、99.2 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別取標(biāo)準(zhǔn)儲備液(見表1)適量并加入流動相，將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋2、3、5、10、50、150倍，用于線性范圍、回收率、準(zhǔn)確度、精密度和穩(wěn)定性的考察。

表1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度(μg/mL)

2.2.2 含藥血漿樣品的配制 取標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別加入流動相適量，將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋6 000、2 000、400、200、120、80、53倍，各取5 μL分別溶于用0.2 mL空白血漿中。用于校準(zhǔn)曲線的建立。血漿標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(見表2)每天臨用前現(xiàn)配制。

表2 血漿標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度

2.2.3 血漿樣品的處理[7]將0.2 mL 6.0%的高氯酸緩慢加入到0.2 mL空白血漿中，將樣品中的血漿蛋白充分沉淀。用3.0 mL乙酸乙酯渦旋提取木樨草素和牡荊素5 min。3 500 r/min 離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液2.0 mL小心轉(zhuǎn)移至干凈的尖底離心管中，室溫下在真空干燥器中揮干乙酸乙酯。向殘留物中加入250 μL流動相，12 000 r/min離心10 min，取上清液進樣。

2.2.4 血漿樣品的采集 大鼠禁食12 h后給予自制結(jié)腸定位膠囊，分別在0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0、24.0 h后采集血液樣本1.0 mL，分別放于含有肝素的5 mL管中，于3 000 r/min分離血漿。以0 h的取樣作為空白血漿，所有血漿樣品的處理方法同2.2.3。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性 實驗色譜條件下，木樨草素和牡荊素分離度良好，理論塔板數(shù)按木樨草素計算不低于4 000，血漿內(nèi)源性雜質(zhì)對于分離木樨草素和牡荊素沒有干擾。木樨草素和牡荊素的保留時間約為11.0 min和17.0 min，見圖1。

2.3.2 線性關(guān)系 以木樨草素、牡荊素的峰面積作為縱坐標(biāo)，以木樨草素、牡荊素的濃度為橫坐標(biāo)，進行線性回歸分析(見表3和4)。結(jié)果表明，鼠血漿中木樨草素和牡荊素校準(zhǔn)曲線在38.50～4 350 ng/mL和16.50～1 860 ng/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相應(yīng)的木樨草素和牡荊素回歸方程分別為y1=0.133 7x+0.541 9(r=0.999 6，n=7)，y2=0.110 3x+0.512 5(r=0.999 4，n=7)。

A：空白血漿色譜圖；B空白血漿中加入1 158 ng/mL木樨草素和495 ng/mL牡荊素的色譜圖；C：給予結(jié)腸定位膠囊4 h后的血漿色譜圖(1為木樨草素，2為牡荊素)

圖1 不同條件下的色譜圖

表3 木樨草素標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)數(shù)據(jù)

表4 牡荊素標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)數(shù)據(jù)

2.3.3 方法與絕對回收率考察 取大鼠空白血漿，分別加入木樨草素和牡荊素標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成低，中，高3種濃度(表5)的標(biāo)準(zhǔn)血漿各5批(n=5)，按2.2.3的方法進行處理，進行回收率考察。

2.3.4 重復(fù)性與精密度 精確配制高、中、低3個濃度(見表6)的血樣，同日內(nèi)測定5批，計算日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)差；隔天測定1批，連續(xù)測定5批，計算日間相對標(biāo)準(zhǔn)差。從結(jié)果可知日內(nèi)精密度<7.9%，日間精密度(RSD)<5.4%，見表6。

表5 回收率考察(n=5)

表6 木樨草素和牡荊素精密度考察(n=5)

2.3.5 穩(wěn)定性 精確配制低、高兩種濃度(38.5/16.5ng/mL，4 350/1 860 ng/mL)的血漿樣品，一式3份，放置于3種不同環(huán)境下進行穩(wěn)定性試驗。在短期穩(wěn)定性試驗中，血漿樣品放置于冰箱中(4 ℃)，分別于0、2、4、8、12、24 h測定；在長期穩(wěn)定性實驗中，血漿樣品放置于冰柜中(-20 ℃)，分別于1、3、7、15、30 d進行測定。結(jié)果表明，短期試驗中回收率變化為94%～105.1%(低濃度)，95.2%～103.2%(高濃度)；長期實驗中回收率變化為97.6%～107.5%(低)，95.2%～103.2%(高)。穩(wěn)定性實驗表明：木樨草素和牡荊素血漿樣本在上述情況下穩(wěn)定性良好。

2.3.6 檢測限及定量限 方法的最低檢測濃度，當(dāng)信噪比S/N=3時，木樨草素和牡荊素的最低檢測限為1.82和1.94 ng/mL。

定量限，樣品中被測物能被定量測定的最低量。大鼠血漿中木犀草素和牡荊素的定量限分別為7.84 ng/mL和6.29 ng/mL，RSD分別為6.2%和5.9%。

3 樣品測定

給予大鼠口服結(jié)腸定位膠囊，按照2.2.4進行血樣采集，測定血漿中木樨草素和牡荊素的濃度(見圖2)。但由于血漿中牡荊素的濃度低于檢測限，只檢測出木樨草素。

圖2 不同時間點血漿中木樨草素濃度

4 討 論

去除血漿樣品中的蛋白質(zhì)是保證藥物釋出與樣品干凈的重要前提。血漿中的蛋白質(zhì)沉淀一般采用沉淀劑或利用酶消化法實現(xiàn)。而蛋白質(zhì)的沉淀效率與介質(zhì)的pH值和沉淀劑體積有關(guān)。在實驗中，分別對乙腈和甲醇的除蛋白效果進行了考察。結(jié)果顯示，兩者蛋白沉淀效果不佳，內(nèi)源性物質(zhì)對物質(zhì)的分離干擾較為嚴(yán)重。最后采用6%的高氯酸，沉淀效果顯著，干擾分離的內(nèi)源性物質(zhì)較少。

從血漿中萃取分離物質(zhì)，多采用不同比例的丙酮與醚類，提取的回收率一般在55%、40%[8]。我們通過對木樨草素和牡荊素兩種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行分析并結(jié)合相似相溶的原理，采用乙酸乙酯進行萃取?；厥章视辛嗣黠@的提升，分別達(dá)到了88%和90%。

流動相的pH對物質(zhì)的出峰時間和峰形有著巨大影響。當(dāng)pH>6.0時，出峰時間在17 min以后，峰寬變寬，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。pH過低，藥物出峰時間前移，但峰形出現(xiàn)分裂，分析認(rèn)為是藥物形態(tài)影響了峰形。即在一定pH條件下，藥物以分子和鹽的形式存在于流動相中。經(jīng)過摸索，最終選擇了甲醇20 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液(58∶42，pH=4.0)作為流動相，譜圖顯示峰形良好。

實驗過程中發(fā)現(xiàn)，木樨草素和牡荊素的代謝情況表現(xiàn)出了極大的差異性。經(jīng)查閱有關(guān)文獻(xiàn)[9]得知，牡荊素的體內(nèi)代謝過程中，體內(nèi)酚的含量會發(fā)生變化，可能是體內(nèi)某些酚類成份參與了牡荊素的代謝過程?？紤]到血漿中木樨草素和牡荊素濃度的差異，推斷兩者具有不同的代謝途徑，參與代謝酶系的活性也有較大的差距。