黃衛(wèi)巍,陳 陽

（皖南醫(yī)學(xué)院：1法醫(yī)病理學(xué)專業(yè)2016級(jí)；2法醫(yī)學(xué)院病理教研室，安徽蕪湖241002）

一氧化碳中毒是法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中十分常見的死亡原因之一。關(guān)于一氧化碳中毒死亡的鑒定主要是依據(jù)碳氧血紅蛋白致死飽和度、尸體現(xiàn)象(血液及組織呈現(xiàn)櫻桃紅色）及案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)的勘察等,然而在實(shí)際檢案中卻經(jīng)常遇到特征性尸體現(xiàn)象不明顯、血液中HbCO遠(yuǎn)低于致死飽和度（50%以下）等問題，給CO中毒死亡的判定帶來一定困難，并引發(fā)很多爭議[1]。c-fos蛋白屬于原癌基因家族，具有即時(shí)、快速反應(yīng)的功能[2]。在正常的生理情況下，c-fos基因及蛋白僅有少量微弱的表達(dá)，當(dāng)腦組織受到一系列的病理或生理的刺激后，c-fos蛋白將大量的表達(dá)。已有研究證實(shí)了c-fos基因及蛋白在腦挫傷、電流損傷等方面的表達(dá)[3-4]，而鮮見有關(guān)c-fos蛋白在急性一氧化碳中毒早期的研究報(bào)告。本研究采用靜態(tài)吸入染毒法建立大鼠急性一氧化碳中毒模型，運(yùn)用Western blot?ting法檢測(cè)c-fos蛋白在一氧化碳中毒大鼠腦組織中早期的變化規(guī)律，免疫組織化學(xué)法觀察c-fos蛋白的表達(dá)部位，以期為法醫(yī)學(xué)推斷急性一氧化碳中毒死亡及死亡時(shí)間提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠，25只，體重280～300 g(南京青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。隨機(jī)分為急性一氧化碳中毒組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，一氧化碳中毒組按中毒后不同時(shí)間點(diǎn)分為3 h、6 h、12 h、24 h組，每一時(shí)間組5只大鼠，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組5只，共25只大鼠。飼養(yǎng)期間保持空氣流通，及時(shí)更換墊料，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，自由飲食，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

一抗c-fos抗體（ABCam，美國）,內(nèi)參β-Tubulin抗體(abclona,美國),預(yù)染蛋白 Marker(Fermentas，美國),二抗羊抗兔IgG-HRP、山羊抗小鼠IgG-HRP、凝膠配制試劑盒(博士德有限公司),SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液5X（博奧森有限公司),RIPA裂解液、PMSF(碧云天生物技術(shù)有限公司），即用型SABC-POD試劑盒、增強(qiáng)型DAB顯色劑（天根有限公司）。60 L的染毒缸（皖南醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院提供），99.9%的一氧化碳?xì)怏w（蕪湖市永泰特種氣體有限公司），一氧化碳檢測(cè)管（上海豫東電子科技有限公司）。

1.3 模型制作

中毒組參照Thom SR方法[5]制做大鼠一氧化碳中毒模型并加以改進(jìn)。將清醒大鼠放入體積為60 L的染毒罐內(nèi)，然后向罐內(nèi)注入濃度為99.9%的一氧化碳?xì)怏w。大鼠在罐內(nèi)靜式吸入3 000～4 000 ppm一氧化碳?xì)怏w30～40 min。在此期間用一氧化碳快速檢測(cè)管監(jiān)測(cè)染毒缸內(nèi)CO氣體濃度，使氣體濃度保持恒定。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組將大鼠放入染毒缸內(nèi)30～40 min，不通入一氧化碳?xì)怏w。

1.4 組織處理

在設(shè)定的不同時(shí)間點(diǎn)將大鼠斷頭處死，取左側(cè)大腦經(jīng)預(yù)冷的生理鹽水清洗后，迅速放入-80℃冰箱冷凍備用，右側(cè)大腦放入10%的甲醛中進(jìn)行固定，以用做HE染色及免疫組織化學(xué)染色。

取出凍存?zhèn)溆玫哪X組織加入RIPA裂解液及PMSF經(jīng)勻漿、離心后，將提取的蛋白用NANOProp 2000檢測(cè)蛋白濃度確定上樣量，加入上樣緩沖液將蛋白100℃煮10 min變性，經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)后，將膠片進(jìn)行掃描，測(cè)定各組灰度值，計(jì)算其與內(nèi)參β-tubulin的比值以用做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 HE染色

將包埋好的組織蠟塊，制成5 μm厚的石蠟切片，在進(jìn)行常規(guī)的脫蠟及水化后采用蘇木素-伊紅染色制成病理切片，采用光學(xué)顯微鏡觀察病理變化。

1.6 免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片在進(jìn)行常規(guī)的脫水、透明后，用3%過氧化氫封閉非特異性抗原，采用高溫高壓修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)（2 000 mL的0.01 moL/L枸櫞酸鈉緩沖液pH 6.0，高壓鍋煮沸，放入玻片，待高壓鍋噴氣后計(jì)時(shí)3 min），c-fos抗體1∶100作為一抗，按照試劑盒提供的說明書進(jìn)行操作。觀察c-fos蛋白的表達(dá)部位及強(qiáng)度變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)中所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用x±s（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANO?VA），兩兩比較LSD法，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠中毒后表現(xiàn)

大鼠染毒約5 min時(shí)出現(xiàn)躁動(dòng)、興奮，圍染毒缸壁打轉(zhuǎn)，呼吸心跳加快。約15 min時(shí)，部分大鼠出現(xiàn)角弓反張、抽搐及聚集現(xiàn)象，后肢肌力明顯減退，少動(dòng)但能對(duì)外界的刺激給予反應(yīng)，尾尖及耳廓呈現(xiàn)櫻桃紅色。30 min時(shí)對(duì)外來的刺激無反應(yīng)，有大小便失禁現(xiàn)象，呈昏迷狀態(tài)。將大鼠放置通風(fēng)處逐漸恢復(fù)意識(shí)。對(duì)中毒死亡大鼠進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟呈櫻桃紅色且有散在出血點(diǎn)，肝臟充血明顯，血液粘稠易凝固。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組大鼠在染毒缸內(nèi)活動(dòng)正常，呼吸均勻，解剖未發(fā)現(xiàn)明顯異常。

2.2 大腦皮質(zhì)病理學(xué)觀察

在普通HE染色觀察大鼠實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與一氧化碳中毒3 h、6 h、12 h各時(shí)間組的組織結(jié)構(gòu)大致相同，腦組織神經(jīng)元核膜核仁清晰可辨，細(xì)胞間隙未見明顯水腫。在一氧化碳中毒24 h組中，腦組織輕度水腫，見圖1。

圖1 兩組大鼠腦組織的病理變化（HE染色，×200）

2.3 Western blotting法檢測(cè)c-fos蛋白的表達(dá)情況

與一氧化碳組比較，c-fos蛋白在對(duì)照組中表達(dá)較少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在一氧化碳中毒各時(shí)間組中c-fos蛋白表達(dá)水平隨著時(shí)間的延長呈現(xiàn)一種“雙峰”趨勢(shì)，即3 h明顯升高后，6 h略為下降，12 h再次升高達(dá)高峰，24 h降低（P＜0.05），見表1，圖2。

表1 c-fos蛋白表達(dá)灰度值(x± s，n=5）

圖2 c-fos蛋白的表達(dá)條帶

2.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)c-fos表達(dá)情況

c-fos蛋白免疫組織化學(xué)染色后呈黃褐色，主要定位于神經(jīng)細(xì)胞胞漿內(nèi)，胞核中亦見有少量的表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)內(nèi)見有少量的c-fos蛋白表達(dá)，而在一氧化碳中毒組則呈強(qiáng)陽性表達(dá)，見圖3。

3 討 論

一般情況下，一氧化碳中毒是由于吸入汽車廢氣、木炭、煤塊、燃?xì)庠?、燃油等不完全燃燒，或者是在火?zāi)等環(huán)境下發(fā)生的[6-8]。一氧化碳中毒的機(jī)制主要是CO進(jìn)入機(jī)體后與血紅蛋白結(jié)合，形成碳氧血紅蛋白（HbCO），碳氧血紅蛋白不易解離釋放氧氣，故造成機(jī)體缺氧，其病理特點(diǎn)主要是組織缺氧所致的各種器官功能障礙，重則危及生命。在法醫(yī)鑒定中，一氧化碳中毒主要依靠檢測(cè)碳氧血紅蛋白的濃度及尸體的特征性征象“櫻桃紅”來進(jìn)行判定。由于碳氧血紅蛋白濃度受自身疾病、飲酒情況及CO來源的不同影響較大，給鑒定也帶來了一定的困難[9-11]。所以尋找敏感可靠的生化指標(biāo)成為法醫(yī)學(xué)者努力探索的方向。

圖3 各組腦組織免疫組織化學(xué)染色（SABC法，×400）

c-fos基因是一種參與多種細(xì)胞功能的原癌基因，也是即刻早基因家族（immediate early genes,IEG）之一，早在三十多年前就已成為研究腦組織中的早期基因，多項(xiàng)研究表明不同的刺激能誘導(dǎo)c-fos的表達(dá)[12]。c-fos基因與c-jun基因編碼的蛋白相結(jié)合，形成AP-1轉(zhuǎn)錄因子，此蛋白可作為第三信使進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而使外界刺激信號(hào)與基因表達(dá)偶聯(lián)，參與一系列的生理或病理活動(dòng)的調(diào)節(jié)[13-14]。在正常的人和大鼠的腦組織中，c-fos蛋白表達(dá)量較少，當(dāng)外界的刺激如缺氧缺血作用于大腦時(shí)，c-fos基因的表達(dá)量就會(huì)發(fā)生顯著且快速的改變[15-17]。

本實(shí)驗(yàn)在建立大鼠一氧化碳中毒模型的基礎(chǔ)上檢測(cè)c-fos蛋白在急性一氧化碳中毒后腦組織中的表達(dá)變化。一氧化碳中毒模型的建立主要有三種：靜態(tài)吸入染毒法、動(dòng)態(tài)吸入染毒法及腹腔注射染毒法。動(dòng)態(tài)吸入染毒法制備模型時(shí)吸入濃度穩(wěn)定且能較好的避免二氧化碳蓄積和缺氧的缺點(diǎn)，但其一氧化碳?xì)怏w消耗量大且不適宜小型動(dòng)物的模型制備。腹腔注射法雖能很好地控制氣體量，但與正常人體中毒方式不符，且中毒較深[18]。本實(shí)驗(yàn)采用靜態(tài)吸入染毒法制備大鼠一氧化碳中毒模型，采用一氧化碳檢測(cè)管監(jiān)測(cè)染毒缸內(nèi)一氧化碳的濃度，且染毒缸較大，可避免染毒過程中的二氧化碳蓄積及氧分壓降低對(duì)本實(shí)驗(yàn)的影響。能使大鼠在正常呼吸的情況下中毒，符合人體中毒方式。

本研究發(fā)現(xiàn)在急性一氧化碳中毒后早期腦組織病理學(xué)形態(tài)改變不明顯。在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組c-fos蛋白有少量的表達(dá)，可能與處死時(shí)的刺激有關(guān)。而一氧化碳中毒組c-fos蛋白在腦組織表達(dá)迅速增加，3 h表達(dá)升高，6 h略為下降，12 h再次升高達(dá)高峰，24 h時(shí)下降。這可能是當(dāng)一氧化碳進(jìn)入機(jī)體，神經(jīng)系統(tǒng)缺氧而應(yīng)激性上調(diào)c-fos蛋白，從而達(dá)到對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用。隨著時(shí)間的延長，c-fos蛋白逐漸下降，但仍高于對(duì)照組。而12 h再次升高，可能是神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)氧損傷所造成，也可能是c-fos蛋白的促凋亡作用引起的繼發(fā)性損害，有待進(jìn)一步研究。在本實(shí)驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)大鼠在輕度中毒后，后肢肌力即減退，隨著中毒程度的加深，肌力逐漸喪失，這也揭示了在中毒案件中，死者一旦中毒就很難逃離中毒現(xiàn)場(chǎng)，也是其死亡率高的原因。

本研究成功復(fù)制了大鼠一氧化碳中毒模型，通過模型研究證實(shí)了c-fos蛋白在一氧化碳中毒中的表達(dá)與Tang YP的研究結(jié)果一致[19]，且發(fā)現(xiàn)在一氧化碳中毒后腦組織病理未發(fā)生變化之前c-fos蛋白即開始表達(dá)并隨著時(shí)間的延長表現(xiàn)出一定的規(guī)律性,對(duì)防治一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病的發(fā)病有一定的臨床意義。c-fos蛋白表達(dá)呈現(xiàn)出較好的即時(shí)性以及時(shí)間的規(guī)律性，為急性一氧化碳中毒的法醫(yī)學(xué)鑒定和中毒時(shí)間的推斷提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。下一步研究重點(diǎn)應(yīng)著重探討c-fos蛋白在一氧化碳中毒腦損傷與其他類型的腦損傷在表達(dá)部位、強(qiáng)度及發(fā)生機(jī)制的差異性。

4 結(jié) 論

25只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及一氧化碳中毒組。Western blotting法檢測(cè)c-fos蛋白在腦組織的變化規(guī)律，免疫組織化學(xué)法觀察c-fos蛋白的表達(dá)部位。結(jié)果顯示：對(duì)照組大鼠腦組織內(nèi)有少量的c-fos蛋白表達(dá)，一氧化碳中毒組在3 h時(shí)即可觀察到c-fos蛋白的大量表達(dá)，6 h略為下降，12 h表達(dá)至高峰，之后逐漸下降，呈“雙峰”趨勢(shì)，且與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比皆有差異性。提示c-fos蛋白的表達(dá)和一氧化碳中毒后經(jīng)過時(shí)間呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。