段麗君，李 秀，余 麗，陳雨荷，邱燕玲，劉旭倩

(1四川省遂寧市射洪縣人民醫(yī)院口腔科，四川遂寧 629200；2西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院)

Dkk家族是近幾年發(fā)現(xiàn)的一類編碼分泌性糖蛋白的抑癌基因，人Dkk家族相關(guān)成員包括Dkk-1，Dkk-2，Dkk-3，Dkk-4以及被稱為Soggy的Dkk-3相關(guān)蛋白[1]。研究表明，Dkk-3在人類多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到抑制作用[2-7]。而β-catenin是一種能與20多種蛋白結(jié)合發(fā)揮多重調(diào)節(jié)功能的蛋白，它不僅是經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號途徑的核心蛋白和整條信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵樞紐分子[8]，而且還具有介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間黏附的重要功能[9]。在正常細(xì)胞膜上的β-catenin、E-鈣粘素和細(xì)胞膜上的骨架蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，介導(dǎo)細(xì)胞間的粘附，當(dāng)β-catenin由胞膜向胞漿或胞核轉(zhuǎn)移時(shí)，上述復(fù)合體減少，使細(xì)胞間的粘附作用降低而易脫落，使腫瘤呈現(xiàn)浸潤式生長方式。本實(shí)驗(yàn)采用4-硝基喹啉-1-氧化物（4-introquinoline-1-oxide，4 NQO)誘發(fā)構(gòu)建SD大鼠頰黏膜癌變模型，運(yùn)用免疫組化法檢測Dkk-3和β-catenin蛋白在大鼠頰黏膜癌變過程中的表達(dá)，以探討Dkk-3與β-catenin蛋白在口腔黏膜癌變發(fā)生過程中的作用及相關(guān)關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

兔抗鼠Dkk-3多克隆抗體（美國R﹠D）；兔抗鼠β-catenin多克隆抗體（美國Abzoom）；免疫組化試劑盒SP-9000（北京中杉金橋）；HE染色試劑盒（北京諾博萊特）；即用型DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋）。

1.2 方法

1.2.1 組織標(biāo)本

收集西南醫(yī)科大學(xué)口頜面修復(fù)重建和再生實(shí)驗(yàn)室提供的4 NQO誘發(fā)SD大鼠口腔黏膜癌變所獲頰部病損組織。其中正常頰黏膜16例，輕度上皮異常增生11例，中度上皮異常增生12例，重度上皮異常增生10例，頰癌9例。PBS代替一抗作陰性對照。

1.2.2 標(biāo)本的處理

所有蠟塊連續(xù)性切片，常規(guī)脫蠟至水，一部分進(jìn)行HE染色作為組織診斷學(xué)用，另一部分進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色：①枸櫞酸鈉緩沖液加熱至96℃15 min，對組織抗原進(jìn)行修復(fù)，PBS沖洗3次；②3%H2O2室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次；③切片分別滴加一抗 Dkk-3（1∶100）和β-catenin（1∶100），37 ℃濕盒內(nèi)孵育1.5 h，PBS沖洗3次；④每張切片滴加1滴生物素標(biāo)記的二抗（工作濃度），37℃下孵育20 min，PBS沖洗3次；⑤滴加鏈霉菌抗生物素－過氧化酶溶液，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次；⑥D(zhuǎn)AB顯色5 min左右，水洗以終止顯色反應(yīng)；⑦蘇木素復(fù)染；酒精梯度上行脫水；二甲苯透明；中性樹膠封片。

1.2.3 結(jié)果判定與統(tǒng)計(jì)

Dkk-3的表達(dá)以正常上皮細(xì)胞的胞漿和胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。光鏡下，每例樣本隨機(jī)選擇10個高倍視野，Motic Medical數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，取平均值，排除非特異性染色和邊緣效應(yīng)，著色強(qiáng)度記分標(biāo)準(zhǔn)：無染色=0分；輕度染色=1分；中等染色=2分；重度染色=3分。陽性率（陽性率是指每例樣本Dkk-3表達(dá)的染色強(qiáng)度得分和陽性細(xì)胞數(shù)得分的乘積≥6的樣本數(shù)占每組總樣本數(shù)的百分率）評分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞數(shù)＜10%（0分）；11%～25%（1分）；26%～49%（2分）；≥50%（3分）。染色強(qiáng)度與陽性率乘積為Dkk-3最后得分≥6分為陽性；＜6分判定為陰性。β-catenin以正常上皮細(xì)胞的胞膜上出現(xiàn)黃色或棕黃色的染色為陽性，如≥70%胞膜陽性表達(dá)者稱為正常表達(dá)，反之為表達(dá)減弱或缺失；≥10%胞漿或胞核陽性表達(dá)者稱為異位表達(dá)；胞膜表達(dá)減弱或缺失和異位表達(dá)統(tǒng)稱為異常表達(dá)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，在χ2檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的前提下再進(jìn)行兩者的Pearson相關(guān)性分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病理資料分析

對所選蠟塊進(jìn)行常規(guī)HE染色，由三位病理科醫(yī)生復(fù)片，對58例標(biāo)本進(jìn)行分組：正常頰黏膜16例；輕度上皮異常增生11例；中度上皮異常增生12例；重度上皮異常增生10例；鱗狀細(xì)胞癌9例，見圖1。

2.2 β-catenin蛋白在SD大鼠頰黏膜癌變過程中的表達(dá)

正常組棘層以上細(xì)胞膜β-catenin陽性表達(dá)，呈棕黃色顆粒，基底層著色不明顯；輕度上皮異常增生組棘層以上細(xì)胞膜陽性表達(dá)減少，部分胞質(zhì)中呈淺黃色弱陽性表達(dá)；中度上皮異常增生組中多數(shù)棘層以上細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)黃色顆粒；重度上皮異常增生組中細(xì)胞層次紊亂，胞漿陽性表達(dá)開始減少但顏色變?yōu)樽攸S色，大量胞核呈陽性；鱗癌組大量胞核陽性表達(dá)，見圖2。

圖1 大鼠正常黏膜（HE染色，×200）

圖2 β-catenin蛋白在大鼠頰黏膜的表達(dá)（Polymer，×200）

在SD大鼠頰黏膜由正常至癌變過程中β-catenin異常表達(dá)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=22.493，P＜0.05）（表1）。β-catenin的異常表達(dá)與病理分級程度成正相關(guān)關(guān)系（rs=0.386,P＜0.05），即認(rèn)為從正常到癌變β-catenin異常表達(dá)水平逐步增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.3 Dkk-3蛋白在SD大鼠頰黏膜癌變過程中的表達(dá)

正常組上皮基底層和棘細(xì)胞胞漿呈陽性表達(dá)，廣泛的棕黃色顆粒，近表層細(xì)胞的胞核中出現(xiàn)少量黃色顆粒；輕度上皮異常增生組上皮基底層和棘細(xì)胞的胞漿陽性表達(dá)減少，但胞核中棕黃色顆粒增加；中度上皮異常增生組上皮的胞漿陽性表達(dá)明顯降低，僅部分細(xì)胞胞漿有淺黃色顆粒，棘層以上的細(xì)胞胞核為陽性表達(dá)，著色細(xì)胞數(shù)明顯減少，基底層幾乎無著色；重度上皮異常增生組上皮僅見極少數(shù)細(xì)胞胞核淺黃色顆粒；鱗癌組上皮細(xì)胞Dkk-3陰性表達(dá)，見圖3。

表1 β-catenin在SD大鼠正常頰黏膜至癌變各階段組織中的異常表達(dá)比較

表2 β-catenin異常表達(dá)差異與頰黏膜病理分級的相關(guān)性分析

圖3 Dkk-3在大鼠頰黏膜中表達(dá)（Polymer，×200）

由表3可見，在SD大鼠頰黏膜由正常至癌變這一動態(tài)變化過程中Dkk-3陽性表達(dá)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=16.113,P＜0.05）。Dkk-3的陽性表達(dá)隨著病理分級程度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（rs=-0.521,P＜0.05），即認(rèn)為從正常到癌變Dkk-3的陽性表達(dá)水平逐步降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表3 Dkk-3在SD大鼠正常頰黏膜至癌變各階段組織中的表達(dá)比較

表4 Dkk-3陽性表達(dá)差異與頰黏膜病理分級的相關(guān)性分析

3 討 論

Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是最經(jīng)典的信號通路之一[10]，當(dāng)這條通路被異常激活時(shí)，可導(dǎo)致β-catenin在胞漿中大量聚集，激活下游的c-ymc、cyclin1等原癌基因，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[11]。β-catenin作為Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵細(xì)胞因子最早是被當(dāng)做粘附因子而發(fā)現(xiàn)的，研究表明它還是一種胞內(nèi)可溶性的多功能蛋白，在細(xì)胞內(nèi)以兩種形式存在：①結(jié)合型：主要位于細(xì)胞-細(xì)胞鏈接側(cè)的細(xì)胞膜上，β-catenin和E-cadherin、細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，介導(dǎo)細(xì)胞之間的粘附，維持正常上皮細(xì)胞的極性和完整性；②游離型：主要位于胞漿中，正常情況下它與APC、GSK-3β和Axin形成的“破壞復(fù)合物”結(jié)合后，被泛素化并由蛋白水解酶降解，從而胞漿始終維持在一個幾乎被檢測不到的水平，但是如果這個復(fù)合物被破壞后，就可導(dǎo)致β-catenin失磷酸化，在胞漿中大量聚集，進(jìn)而進(jìn)入胞核啟動下游的原癌基因，介導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化。β-catenin以上兩種存在形式表明，其表達(dá)異常不僅可降低細(xì)胞間的粘附性，還受Wnt/β-catenin信號通路的開關(guān)閉狀態(tài)影響，它對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著雙重推進(jìn)作用。研究證實(shí)，β-catenin在胞漿和胞核中表達(dá)量的增加與腫瘤的增殖、分化和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12]。本實(shí)驗(yàn)顯示，β-catenin異常表達(dá)與SD大鼠的頰黏膜病理惡性程度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，在頰黏膜癌變過程中β-catenin的異常表達(dá)數(shù)的差異在總體上是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的（P＜0.05），可能與β-catenin由胞漿向胞核轉(zhuǎn)移后啟動了細(xì)胞核內(nèi)的癌基因有關(guān)；因β-catenin隨著病理分化程度的降低在細(xì)胞膜上的表達(dá)量也降低，使細(xì)胞之間的粘附性降低，導(dǎo)致細(xì)胞更易脫落和侵襲下層組織。這些結(jié)果與學(xué)者顧曉荔等[13]對β-catenin在宮頸鱗癌中的表達(dá)研究相一致，同時(shí)與胡冬玉等[14]研究的β-catenin在皮膚鱗癌及癌前病變中的表達(dá)變化相吻合，提示β-catenin可能在SD大鼠口腔頰黏膜癌變過程中起促進(jìn)作用。

Dkk-3是近幾年發(fā)現(xiàn)的一類編碼分泌性糖蛋白的抑癌基因，定位于人類經(jīng)常缺失的染色體11p5.1的位點(diǎn)上，研究發(fā)現(xiàn)Dkk-3與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15-18]。本實(shí)驗(yàn)對Dkk-3在SD大鼠頰粘膜癌變過程中的表達(dá)變化進(jìn)行探討，結(jié)果顯示Dkk-3在大鼠正常頰黏膜高表達(dá)，表達(dá)部位與童輝等[19]對Dkk-3蛋白在乳腺癌中表達(dá)研究結(jié)果相似。本實(shí)驗(yàn)中Dkk-3的陽性表達(dá)率隨著頰黏膜病理分化程度的降低而降低，在重度上皮異常增生組中Dkk-3陽性表達(dá)率僅為20﹪，表達(dá)部位與牛云霞等[20]對Dkk-3在直腸癌組織中的免疫組化染色結(jié)果相同。Dkk-3在鱗癌組表達(dá)缺失，正常組和上皮異常增生組相比，它們之間的差異在總體上是具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。關(guān)于Dkk-3在正常組織和腫瘤組織中表達(dá)部位的不同，目前鮮有報(bào)道，本研究推測是因?yàn)樵谡＝M織中Dkk-3的陽性表達(dá)量本身就很高，使絕大多數(shù)Dkk-3主要聚集在胞質(zhì)中，易于從胞質(zhì)中游離出來和胞膜表面的Wnt輔助性受體LRP5/6結(jié)合，抑制Wnt受體復(fù)合物形成；隨著病理分化程度的降低，Dkk-3表達(dá)的部位主要出現(xiàn)在胞核中，但是陽性表達(dá)率是顯著降低的，兩者間的相關(guān)性分析顯示Dkk-3陽性表達(dá)的差異與頰黏膜病理惡性程度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。Dkk-3在大鼠頰黏膜癌變過程中表達(dá)量的變化與國內(nèi)外學(xué)者在腫瘤方面的研究結(jié)果基本一致。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了Dkk-3作為抑癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起抑制作用，其表達(dá)量和病理分化程度成正相關(guān)關(guān)系。以上數(shù)據(jù)提示，Dkk-3在異常增生組織和癌組織中的表達(dá)并不是完全缺失，仍然有Dkk-3陽性表達(dá)的組織會發(fā)生癌變。

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)分析了Dkk-3和β-catenin在SD大鼠頰黏膜癌變過程中表達(dá)變化的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果顯示，Dkk-3和β-catenin在大鼠頰粘膜癌變過程中呈負(fù)性相關(guān)關(guān)系。同時(shí)證明了Dkk-3對Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有抑制作用，Dkk-3與細(xì)胞膜上的輔助性受體LRP5/6相結(jié)合，阻止Wnt蛋白和受體Frizzled及輔助性受體LRP5/6結(jié)合形成受體復(fù)合物，使得胞質(zhì)內(nèi)Dsh蛋白不能被活化，未活化的Dsh蛋白不能抑制糖原合成酶激酶3β（GSK3β）的活性，從而使軸蛋白（Axin）、結(jié)腸腺瘤樣息肉（APC）蛋白和β-catenin等不能形成降解復(fù)合體，胞質(zhì)內(nèi)的酪蛋白激酶1（CK1）和GSK3β就不能對β-catenin進(jìn)行磷酸化[21-22]。未被GSK3β磷酸化的β-catenin同時(shí)也避免了被泛素連接酶E3亞基β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素重復(fù)蛋白（β-TrCP）的識別和被26S蛋白酶體降解,從而在胞質(zhì)中逐漸積聚，當(dāng)積聚到一定閾濃度后開始向胞核轉(zhuǎn)移,并與胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子Tcf/Lef相結(jié)合，招募共同轉(zhuǎn)錄起始因子激活一系列的下游靶基因,如c-myc、cyclin1、survivin等而導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和分化。正常細(xì)胞中的Dkk-3與LRP5/6結(jié)合，關(guān)閉經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路[23]，使得胞質(zhì)中游離的β-catenin維持在較低的水平。同時(shí)，在正常細(xì)胞胞膜上的β-catenin大部分與胞膜粘附蛋白E-cat等結(jié)合形成復(fù)合體參與細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié),調(diào)節(jié)細(xì)胞之間的粘附，防止細(xì)胞脫落[24]。

4 結(jié) 論

Dkk-3能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來調(diào)節(jié)β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)的表達(dá)水平，使β-catenin的異常表達(dá)量始終處于較低水平，防止下游靶基因的轉(zhuǎn)錄從而降低細(xì)胞增殖、分化，通過降低細(xì)胞脫落率降低腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。