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        雙效工程菌Y1溶藻產(chǎn)物的急性毒性與健康風(fēng)險評估

        2018-08-31 08:53:20潘瑞松沈紅池吳旭鵬蔡慶慶王明新張文藝
        關(guān)鍵詞:藻液溶藻菌劑

        潘瑞松,沈紅池,吳旭鵬,蔡慶慶,王明新,張文藝

        (1.常州大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院,江蘇 常州 213164;2.常州環(huán)??萍奸_發(fā)推廣中心,江蘇 常州 213022)

        中國南方飲用水多取自于淡水湖泊、河流及水庫。隨著水體富營養(yǎng)化的加重,水源地藍(lán)藻爆發(fā)日益頻繁[1-2]。藍(lán)藻爆發(fā)不僅導(dǎo)致水質(zhì)下降,還會產(chǎn)生藻毒素,其中微囊藻毒素(Microcystins,MCs)具有極強(qiáng)的肝、腸致癌毒素,嚴(yán)重危害著人們的健康,所以保護(hù)水源水迫十分急迫[3-5]。生物法是近年來興起的、利用溶藻細(xì)菌控制水體藻類繁殖的一種控藻方法,其基本控藻機(jī)制一是通過直接與藻接觸殺藻,二是通過菌分泌的胞外物質(zhì)殺藻[6-7]。但對溶藻產(chǎn)物及藻溶解后生物殘留物的急性毒性、健康風(fēng)險和致突變鮮有研究[8]。

        發(fā)光細(xì)菌是一種在自然狀態(tài)下能夠發(fā)出熒光的細(xì)菌,現(xiàn)廣泛應(yīng)用于水、土壤、沉積物等方面的毒性測定,是一種快捷、高效、廉價的毒性測試方法[9-11]。健康風(fēng)險評價是評價人體長期攝入某種有害物質(zhì)后對人類造成的傷害[12-14]。而為了確保居民飲用水安全,對含MC的水可能造成的危害進(jìn)行健康風(fēng)險評價是十分必要的。健康風(fēng)險評價采用模型計(jì)算有毒物質(zhì)對人群的影響,美國(USEPA)推薦的模型是較為常用的評估模型[15-16]。

        將已構(gòu)建的溶藻和藻毒素雙效工程菌Y1制成菌劑,利用發(fā)光細(xì)菌研究其對銅綠微囊藻降解產(chǎn)物的毒性。采用美國環(huán)保署EPA推薦的健康風(fēng)險模型——有機(jī)物致突變強(qiáng)度的預(yù)測模型公式[15]對水源水、曝氣生物濾池(BAF)處理水和Y1菌劑強(qiáng)化處理水進(jìn)行健康風(fēng)險評估。

        1 材料與方法

        1.1 菌劑培養(yǎng)基和菌種

        1)菌種:采用本課題組專利“一種溶藻/藻毒素降解雙效工程菌Y1及其構(gòu)建方法(專利201310419121.5)”中的菌劑Y1菌(Bacillussphaericus,保藏號CGMCC NO.7519)。

        2)培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,NaCl 15 g,蒸餾水1 L,pH 7.2~7.4。

        1.2 銅綠微囊藻來源及培養(yǎng)

        選用的藻種為銅綠微囊藻(M.aeruginosa)FACHB-905,購于中科院武漢水生生物研究所國家淡水藻種庫。將購買的藻靜置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)箱條件:溫度28℃、光照強(qiáng)度2 500 lx、光照周期比12 h∶12 h。

        1.3 菌劑Y1制備方法

        用接種環(huán)取斜面培養(yǎng)基上的Y1菌置于高壓滅菌后的液體培養(yǎng)基內(nèi)在140 r·min-1的震蕩箱內(nèi)恒溫震蕩24 h。

        1)菌液投加比對溶藻產(chǎn)物的急性毒性試驗(yàn) 將培養(yǎng)18 h的菌液分別以菌藻比1∶5,1∶10,1∶20的量投加,并于溫度28 ℃、光強(qiáng)2 500 lx、光暗周期12 h∶12 h條件下,在光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),取樣測定葉綠素a的濃度和培養(yǎng)液急性毒性。

        2)初始藻液質(zhì)量濃度的溶藻產(chǎn)物急性毒性試驗(yàn) 將培養(yǎng)18 h的菌液分別以菌藻比1∶10的量投加到不同初始濃度的新鮮藻液中,并于溫度28 ℃、光強(qiáng)2 500 lx、光暗周期12 h∶12 h條件下,在光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),取樣測定葉綠素a的濃度和培養(yǎng)液急性毒性。

        1.4 檢測方法

        1)葉綠素a的測定:Chla測定[17]:參照國家環(huán)保總局編的《水和廢水監(jiān)測分析方法(第四版)》,其中的丙酮用乙醇代替。

        2)發(fā)光細(xì)菌急性毒性測定:發(fā)光細(xì)菌遇到毒性物質(zhì),發(fā)光會受到抑制。對照和樣品均設(shè)兩個平行管,將管子按照順序排布,凍干菌劑用稀釋液活化15 min后,加100 μL到每個試管中,過15 min后測空白。以NaCl稀釋液作為對照,2 000 μL待測樣品加入200 μL調(diào)解液混勻,兩個平行管每管900 μL,過15 min后測發(fā)光亮。

        cF=b/a

        e%=c×cF-d/c×cF×100%

        相對發(fā)光度%=1-e

        式中:a為對照組的空白;b為對照組測定數(shù)據(jù);cF為對照組的相對剩余發(fā)光度;c為樣品組的空白;d為樣品組測定數(shù)據(jù);e為光損。

        1.5 BAF處理水源水健康風(fēng)險評價方法

        國際癌癥研究署(IARC)將化學(xué)物的分類為Ⅰ級(致癌)、ⅡA級(很可能致癌)、ⅡB級(可能致癌)、Ⅲ級(無法歸類)和Ⅳ級(很可能不致癌)。MC-LR屬于ⅡB級,對人類致癌性證據(jù)有限[18]。非致癌風(fēng)險值計(jì)算公式為[19]

        (1)

        式中:RfD為MC-LR進(jìn)入人體的參考劑量(mg/kg·d)。目前尚無MC-LR的RfD的值,國際上通用0.04 μg/(kg·d)作為其值;CDI為長期通過飲用水方式每日每千克體重下的攝入量mg/(kg·d)。

        在飲水途徑暴露下,CDI的計(jì)算公式為

        (2)

        式中:C為水源水中MC-LR所存在的濃度,mg/L;IR為成人飲水率,USEPA建議值為2 L/d;EF為暴露于致癌物質(zhì)的頻率,即接觸含MC-LR水的頻率,定該值為365 d/a;ED為接觸MC-LR總共所持續(xù)的時間,USEPA推薦的數(shù)值為30 a;BW為攝入MC-LR的人體體重,通過國家標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為60 kg;AT為接觸引用水的時間,對于非致癌健康風(fēng)險該值為ED×365 d/a[20]。

        1.6 有機(jī)物致突變強(qiáng)度的預(yù)測模型

        研究表明水質(zhì)參數(shù)如氮磷、COD、pH和 UV254等數(shù)值與致突變強(qiáng)度有密切聯(lián)系。學(xué)者們就水質(zhì)參數(shù)與致突變強(qiáng)度(Mutation Rate,MR)建立了多種模型[21]。建立水質(zhì)參數(shù)與致突變強(qiáng)度的預(yù)測模型能為水環(huán)境監(jiān)測部門提供檢測水質(zhì)毒性強(qiáng)度的便捷方法。有關(guān)于UV254與致突變強(qiáng)度的預(yù)測模型,在此模型中以UV254數(shù)值作為自變量,以定量水樣致突變強(qiáng)度為因變量。多項(xiàng)研究揭示了UV254和溫度與水質(zhì)有機(jī)物致突變強(qiáng)度有較高的相關(guān)性。本研究采用多元回歸方程

        MR=12.749×UV254+0.054×temp+0.312,引入UV254和溫度2個指標(biāo)[22]。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 菌液投加比例對溶藻產(chǎn)物的急性毒性

        將初始葉綠素a濃度34.92 mg/m3的藻液加入不同菌量于28 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 d,測定空白樣和加菌樣的葉綠素a,發(fā)現(xiàn)加入菌劑Y1均能對銅綠微囊藻產(chǎn)生降解作用。隨著時間的增加降解率提高,在第6 d葉綠素a的量均為0。在此基礎(chǔ)上,研究不同菌藻比對發(fā)光細(xì)菌的毒性研究,以未加菌液的銅綠微囊藻為對比,在第3 d時,空白、1∶10、1∶5的相對放光度都降低了,而菌藻比1∶20的相對發(fā)光度上升了,到了第6 d,各溶液的相對發(fā)光度繼續(xù)減少,投菌量越多,對發(fā)光細(xì)菌的抑制作用越強(qiáng),藻細(xì)胞經(jīng)過Y1菌的降解毒性反而增強(qiáng)了。可能的原因是藻量較少導(dǎo)致菌大量繁殖,而Y1菌為球形芽孢桿菌,球形芽孢桿菌能夠作為殺蚊劑,具有一定的毒性[23]。

        圖1 菌藻比對溶藻產(chǎn)物毒性影響Fig.1 Effect of algae ratio on the acute toxicity

        圖2 不同初始濃度對溶藻產(chǎn)物毒性影響Fig.2 Effect of the initial Microcystis aeruginosa concentration on the acute toxicity of algae-lying

        2.2 初始藻液質(zhì)量濃度對溶藻產(chǎn)物急性毒性影響

        在初始葉綠素a濃度分別為34.92 mg/m3、46.56 mg/m3、58.2 mg/m3的藻液中投加1∶10的Y1菌液,由圖可知,Y1菌液對不同初始濃度的藻液均有降解效果。在第3 d分別降解至21.22 mg/m3、21.12 mg/m3、23.38 mg/m3,初始濃度高抑制效果更好,處理6 d后Y1菌均能將藻完全殺死。對于不同初始濃度的藻液進(jìn)行發(fā)光細(xì)菌的毒性研究,從第1 d的數(shù)據(jù)可以看出,藻初始濃度越高對發(fā)光細(xì)菌的抑制能力越強(qiáng)。隨著未加菌樣葉綠素a濃度的提高,其相對發(fā)光度隨之降低,藻濃度越高,相對發(fā)光度越低。加入1∶10的Y1菌液后,濃度2和3的水樣相對發(fā)光度雖然降低,但與對照組相比,其對發(fā)光細(xì)菌的毒性并沒有那么強(qiáng)。菌液作用6 d后,處理組的相對發(fā)光度分別為71.75%、77.10%、69.47%,而對照組為80.02%,66.63%,66.47%。說明水樣中微量的藻毒性較小,而藻濃度較高時,水中的藻毒素的含量因藻的代謝和破裂比低濃度時更高[24],Y1菌劑是溶藻和降解藻毒素的雙效工程菌,投加菌劑后既能溶解藻又將產(chǎn)生的藻毒素也降解了,能夠有效的降低水質(zhì)的急性毒性。

        2.3 BAF進(jìn)出水源水健康風(fēng)險評價

        向其中一個BAF裝置中投加250 mL 1.87×105cfu·mL-1的Y1菌液。以BAF裝置處理的進(jìn)出水樣中MC-LR質(zhì)量濃度為基礎(chǔ),運(yùn)用式(2)計(jì)算出MC-LR的長期攝入量并通過非致癌風(fēng)險值計(jì)算式(1)計(jì)算出R值。通過BAF工藝處理過的水源水MC-LR濃度都下降了。由測定的藻毒素含量可知未加菌的1號BAF進(jìn)水MC-LR濃度在2.89~4.75 μg/L之間,而加菌的2號BAF進(jìn)水MC-LR濃度在3.34~4.87 μg/L之間,1號出水濃度為1.56~3.33 μg/L,2號加菌處理后的濃度在0.72~3.37 μg/L。水樣中MC-LR的R值為2.4 ~ 4.05,經(jīng)過處理之后水樣的毒性均減小了,1號BAF工藝出水R值最低1.3,最高2.8,而加菌以后對MC-LR的去除效率更高,R值為0.6 ~ 2.8。

        表1 投菌和未投菌的BAF處理水中MC-LR濃度Table 1 The concentration of MC-LR in the treated water of BAF with and without bacteria Y1

        通常認(rèn)為R值>1對人的身體有害,R值≤1對人的身體危害較小[25]。通過上述計(jì)算可知處理前的水中MC-LR的R值均>1,原水中MC-LR含量超標(biāo)嚴(yán)重影響人體健康,經(jīng)過BAF處理后出水的R值明顯減小,但由于原水樣的MC-LR濃度過高,處理后的水樣仍然損害人體,加菌處理的水樣處理效果比未加菌的樣好,處理完的水最低R值達(dá)到0.6,小于1,符合要求。

        2.4 有機(jī)物致突變強(qiáng)度的預(yù)測模型

        從3月28日至4月29日中選取8 d測定水溫和Y1菌強(qiáng)化后BAF裝置的進(jìn)出水UV254數(shù)值。通過測得的數(shù)據(jù)可知,經(jīng)過處理后水的UV254遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于進(jìn)水值。UV254數(shù)值能夠很好的確定水中大分子有機(jī)物的量,這些大分子包括一些能致癌的芳香族化合物。通過回歸方程計(jì)算得到不同UV254下的回復(fù)突變率MR。通常認(rèn)為MR>2則有致突變性,而MR≤2即為無致突變性。未經(jīng)處理的源水MR在2.24 ~ 3.06之間,均大于2具有致突變性,而經(jīng)過處理后水的MR在0.46 ~ 0.85之間,遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于2,基本清除致突變性。

        表2 有機(jī)物致突變強(qiáng)度Table 2 Mutagenicity of organic compounds

        3 結(jié)論

        1)由于Y1菌為球形芽孢桿菌具有一定毒性,當(dāng)藻濃度過低時加入Y1菌劑的毒性要比不加菌高。而藻濃度越高,對發(fā)光細(xì)菌毒性越大,加菌后葉綠素a濃度降低,對發(fā)光細(xì)菌的毒性也隨之降低,分析說明溶藻產(chǎn)物對發(fā)光細(xì)菌的毒性并不大。

        2)健康分險評價模型分析表明,未經(jīng)BAF處理過的水中MC-LR的R值為2.4~4.05,對人體的傷害很大,處理過后的水R值明顯減少為1.3~2.8,加Y1菌的BAF出水MC-LR的R值最低達(dá)到0.6,低于基準(zhǔn)值,無健康風(fēng)險。UV254與致突變強(qiáng)度的預(yù)測模型分析表明,處理前的水中有機(jī)物MR>2,具有致突變性,而經(jīng)過處理的水MR遠(yuǎn)小于2,基本無致突變性,說明Y1應(yīng)用于水源水無生物毒性和致突變風(fēng)險。

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