董小娜，陳澤慧，毛林強，王明新，張文藝

(常州大學 環(huán)境與安全工程學院，江蘇 常州 213164)

每年夏秋季一些水體均發(fā)生有害藻華(HAB)暴發(fā)，給水環(huán)境生態(tài)帶來極大威脅，探索行之有效的溶藻方法迫在眉睫。利用溶藻菌(algicidalbacteria)溶藻安全高效，具有廣闊前景。近年來,學者們在溶藻菌的篩選、溶藻活性代謝產(chǎn)物分析、溶藻微生物的溶藻機理等方面的研究相當活躍，包括溶藻菌株的分離鑒定、溶藻性質(zhì)的描述、溶藻方式的探討、溶藻活性物質(zhì)的分離與純化[1-2]以及溶藻機理的研究等。尤其溶藻機理的研究更是深入到基因水平(分子水平)：藻細胞的細胞水平[3-4]、功能酶和蛋白水平[5-6]等。近年來溶藻菌的篩選成果頗多[7]，已分離鑒定出來的菌屬有粘細菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬等[8]，因藻類的暴發(fā)與溶藻菌的生長息息相關(guān)，這些溶藻菌多來自藻華頻繁暴發(fā)地帶。細菌溶藻方式主要有2種：直接溶藻與間接溶藻，見諸報道的溶藻菌多具有間接溶藻特性[9]。對溶藻能力的測定方法有：藻細胞數(shù)量的變化、chl-a含量的變化及其采用藻膽蛋白(某些藻類如藍藻)的含量變化等。對溶藻機理的研究越來越多，眾多分析方法被用于揭示溶藻產(chǎn)物溶藻機理，如：傅里葉紅外光譜、熒光光譜、透射電鏡等[10]。細菌分泌的物質(zhì)(如氨基酸、抗生素、多肽等)[11]成分復雜，不同的溶藻菌分泌有效溶藻成分也不盡相同，這讓溶藻活性物質(zhì)的分離純化非常困難，目前分離純化出有效溶藻物質(zhì)罕見報道。報道的溶藻活性物質(zhì)的分離純化主要有2種方法：硅膠柱層析[12]與高效液相色譜(HPLC)方法[13]。對活性物質(zhì)的鑒定方法有液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)[13]、液相二級質(zhì)譜(LC-MS-MS)等。但這還僅僅只是限于實驗室研究階段，在實踐中直接利用的效果并不理想，其活性物質(zhì)的分離純化困難且收集率低，這使得生物菌劑投產(chǎn)與使用都難以實現(xiàn)。

采用三維熒光技術(shù)對藻膽蛋白的測定來表征溶藻效果，借助三維熒光光譜解析溶藻降解產(chǎn)物；通過對菌液進行熱處置、破碎處置、酸堿處置、透析處置等手段研究了菌株R1 Lysinibacillus macroides的溶藻機理；并通過HPLC技術(shù)初步分離提取了有效溶藻物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 藻種來源：銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)購自中國科學院武漢水生生物研究所。

菌種來源：從太湖激浪魚內(nèi)臟(魚鰓、魚腸等)中篩選出了1株溶藻效果較佳的菌株R1，培養(yǎng)2 d后，菌落呈圓形，直徑大約1～2 mm，白色，表面光滑，微微凸起，邊緣光滑，生長快速；革蘭氏染色呈紫色,為陽性菌(如圖1)，經(jīng)生理生化及16S rDNA序列分析，其與Lysinibacillusmacroides相似性最高，達99.50%。

圖1 R1革蘭氏染色

1.1.2 主要儀器和試劑 1)試劑：試劑均為中國產(chǎn)分析純試劑。

2)儀器：離心機、超聲波細胞粉碎機、高壓蒸汽滅菌鍋、倒置顯微鏡、島津紫外分光光度計UV-1800、Cary Eclipse熒光分光光度計等。

1.1.3 培養(yǎng)基及其他試劑 LB培養(yǎng)基[14]、銅綠微囊藻培養(yǎng)基BG-11[15]

1.2 方法

1.2.1 菌株溶藻能力考察 為探索菌株R1的溶藻效果，取10 mL培養(yǎng)24 h的R1菌液接種到100 mL銅綠微囊藻溶液中(初始chl-a含量為205.11 mg/L)，27 ℃、光暗比12 h∶12 h周期下培養(yǎng)，每天定期手動搖晃2～3次，每隔2 d測得chl-a含量變化，通過式(1)[16]計算溶藻率并繪制曲線，同時做空白對照。

η=(Cc-Ct)/Cc×100%

(1)

式中：η為溶藻率,%；Cc為初始chl-a含量,mg/L；Ct為后期chl-a含量,mg/L。

1.2.2 三維熒光考察溶藻效果 通過測定chl-a含量的方法考察溶藻效果較為繁瑣，測定時間較長，且需要耗費許多提取物；使用顯微鏡觀察藻細胞形態(tài)數(shù)量是最傳統(tǒng)的浮游藻類分析方法，該方法工作量大，比較繁瑣，且有時辨別不清[17]。銅綠微囊藻有很強的熒光特性的藻膽蛋白，是一種卟啉類色素蛋白，卟啉具有π電子結(jié)構(gòu)[9]，在特定的波長照射下有很強的熒光反應。熒光光譜分析方法快速、準確、樣品不需要特別處置、簡單高效。銅綠微囊藻細胞具有如下熒光特性：藻密度與發(fā)射波長無關(guān)[18]，在低濃度下，熒光強度與溶液濃度成正比，可進行定量分析[18-20]。

為表征菌株溶藻過程，對菌藻混合液(參照1.2.1)進行了三維熒光譜圖分析，取菌藻混合液，進行三維熒光掃描，發(fā)射波長(簡稱Em)280～900 nm/280～550 nm，激發(fā)波長(簡稱Ex)220～800 nm/220～400 nm；狹縫寬度為5 nm；

每隔一段時間收集混合液測Em為650 nm的三維熒光光譜，通過式(2)[21]計算溶藻率并繪制曲線。

η=(Fc-Ft)/Fc×100%

(2)

式中：η為溶藻率，%；Fc為藻膽蛋白初始光強，A.U；Ft為后期藻膽蛋白的光強，A.U。

1.2.3 三維熒光圖譜EMMs結(jié)合平行因子分析考察溶藻產(chǎn)物 為表征菌株溶藻產(chǎn)物，對降解后的藻液進行了三維熒光譜圖分析，發(fā)射波長(簡稱Em)280～550 nm，狹縫寬度為2 nm；激發(fā)波長(簡稱Ex)220～400 nm；狹縫寬度為5 nm；同時，考察純藻液及其菌液的熒光特性。EEMs分析物質(zhì)鑒定，主要采用目視鑒定，無法避免光譜重疊帶來的誤差且具有主觀性。采用三維熒光圖譜結(jié)合平行因子分析考察溶藻產(chǎn)物：1)數(shù)據(jù)預處理：并用Delauay三角形內(nèi)插值法瑞利散射及拉曼散射。2)平行因子分析：平行因子算法是基于三線性分解理論，采用交替最小二乘原理，進行迭代的三維數(shù)陣分解算法?？梢詫⒁粋€由多個三維熒光光譜矩陣分解為3個方向的載荷矩陣。通過對半檢驗法(split-half analysis)，殘差平方和的最小，及核一致性檢驗來確定模型的有效性。采用MATLAB軟件中的Nway toolbox運行[22-24]。

1.2.4 菌株的溶藻特性 為探討溶藻細菌的溶藻機制，將培養(yǎng)24 h溶藻細菌R1培養(yǎng)液進行如下處理:

1)離心過濾上清液(8 000 r/min，10 min；過0.22 μm濾膜)、高熱處理上清液(121 ℃，20 min)、菌體破碎液(取離心后的菌體沉淀超聲波破碎)[16]。

2)酸堿化處置[12]：為考察pH對溶藻物質(zhì)活性的影響，分別調(diào)節(jié)菌液pH為4、7、10，處置1 h后調(diào)回中性，同時做不加菌的空白對照，接菌量為10%(體積)，采用多孔細胞培養(yǎng)板(biologix 24孔板)進行溶藻實驗，并采用顯微鏡計數(shù)法檢查溶藻效果。

3)截留分子量[12]：為考察溶藻活性物質(zhì)的分子大小，分別采用截留分子量為100、500、1 000 da的透析袋對培養(yǎng)24 h后的菌液進行透析1 d，取透析袋中截留液于裝載銅綠微囊藻溶液的24孔板中，檢查溶藻效果。

1.2.5 溶藻活性物質(zhì)的純化與分離[13]

1)菌液前處理：接種菌株R1至500 mL的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、135 r/min，培養(yǎng)24 h；采用0.45 um的濾膜過濾；收集菌液并加入4倍體積的乙醇進行萃取，磁力攪拌30 min，后靜置2 h；使用0.22 um的濾膜過濾；收集菌液60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；無菌水重溶，4 ℃保存。

2)HPLC：通過液相色譜初步確定可能性溶藻物質(zhì)。色譜條件為：色譜柱wonda sil C18(4.6×250 mm)，流動相A(甲醇)∶B(1%乙酸)為1∶9，檢測波長為UV200 nm。

3)為考察這幾個物質(zhì)是否含有溶藻活性物質(zhì)，每隔一段時間收集1餾分，氮氣吹干，超純水重溶，并采用24孔板進行溶藻效果檢驗。對有溶藻活性的收集液，再次使用HPLC檢查其純度及其峰值。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株R1的溶藻能力

將R1菌液到銅綠微囊藻溶液中(初始chl-a為205.11 mg/L)進行實驗，通過肉眼觀察顏色變化及chl-a含量測定檢驗溶藻效果，如圖2。實驗4 d后，肉眼可見混合液發(fā)生黃化現(xiàn)象，chl-a含量不斷減少，10 d后剩余chl-a含量僅為35.61 mg/L，降解率達82.64%；同時觀察到空白樣顏色更加深綠，經(jīng)測定chl-a含量，從初始205.11 mg/L增長到324.56 mg/L。

圖2 溶藻細菌R1對chl-a含量的影響Fig.2 Effects of R1 on chlorophyll

2.2 三維熒光分析R1溶藻能力

取0、3、7、10、12 d的菌藻混合液進行三維熒光光譜掃描并分析，如圖3。溶藻過程中藻膽蛋白熒光峰Em/Ex為650 nm/630 nm，熒光光強不斷減少。為表征其溶藻效果，通過固定Em為650 nm，將得到的熒光光譜減去去離子水的熒光光譜以去除瑞利散射的影響，將瑞利散射峰置零[18]，采用oringin8.6擬合得到光強與激發(fā)波長的關(guān)系圖，如圖4。按照式2)計算，10 d溶藻率為達89.80%，與通過chl-a表征的溶藻率82.64%相近，可作為溶藻細菌溶藻效率的一種評價方法。

圖3 菌藻液的三維熒光圖Fig.3 Three-dimensional fluorescence of

圖4 Em 650 nm的激發(fā)光譜及溶藻效果圖Fig.4 The excitation spectra at the transmitting wavelength of 650 nm and Dissolving rate of

2.3 菌株R1溶藻機制研究

1)由表1及圖5(1)看出：R1菌原液、離心上清液、高溫滅菌液都發(fā)生了明顯的黃化現(xiàn)象，溶藻效果顯著；菌體破碎液及菌體沒有溶藻效果；可見，其溶藻物質(zhì)并不是胞內(nèi)物質(zhì)，也不是菌株本身，而是細菌分泌的胞外物質(zhì)，具有耐高溫的特性，推測為非蛋白質(zhì)類物質(zhì)。

2)由表2及圖5(2)看出，經(jīng)過不同處置的R1菌液都具有很強的溶藻效果，與空白對比，藻液均發(fā)生明顯的黃化現(xiàn)象；顯微鏡計數(shù)結(jié)果見表2，從表中可見，藻細胞數(shù)量都明顯減少，由此可見，溶藻活性物質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定，具有耐酸耐堿性。

3)經(jīng)100、500、1 000 da的透析袋截留分子量后袋中截留液，顯微鏡計數(shù)結(jié)果見表3，發(fā)現(xiàn)溶藻能力強弱順序依次為100 da>500 da>1 000 da，其中，1 000 da溶藻活性很低，由此可見，細菌分泌的有效溶藻物質(zhì)為小分子物質(zhì)，分子量小于500 da。

表1 不同菌體處理方式對溶藻效果的影響Table 1 Effect of different gloop treatment methods on algae-lysing efficiency (cell·mL-1)

表2 不同pH處置方式對溶藻效果的影響Table 2 Effect of different pH disposal methods on algae-lysing efficiency (cell·mL-1)

表3 不同截留分子量對溶藻效果影響Table 3 Effect of different molecular weight on algae-lysing efficiency (cell·mL-1)

圖5 R1菌液經(jīng)不同處理對溶藻的效果影響Fig.5 The algae-lysing efficiency of R1 bacteria solution

2.4 三維熒光圖譜結(jié)合平行因子模型分析R1溶藻產(chǎn)物

菌株R1溶藻過程中,Em/Ex為400～600 nm/250～450 nm處出現(xiàn)了大面積的熒光反應，熒光光譜不成規(guī)則的圓形，成分復雜，如圖3。分別對銅綠微囊藻分泌物、菌液及其降解后的菌藻共培液液進行三維熒光光譜掃描，三維矩陣圖譜見圖6，分別為藻細胞產(chǎn)生的溶解性代謝性產(chǎn)物(EOM)(Em/Ex 335 nm/280 nm)、R1菌液的主要溶解性熒光組分(Em/Ex 335 nm/280 nm、Em/Ex 435～475 nm/350～380 nm、Em/Ex 475 nm/280 nm)及溶藻產(chǎn)物組分(Em/Ex 335 nm/280 nm、 Em/Ex 335 nm/230 nm)。

圖6 菌藻混合液的三維熒光光譜EMMsFig.6 Three-dimensional fluorescence spectra of algal

運用PARAFAC模型結(jié)合EMMs圖譜對溶藻產(chǎn)物的三維熒光矩陣進行解析，并通過殘差和最小分析法及裂半分析法，識別出溶藻混合液共含有可分為2個類型。分別為：475 nm/250～350 nm；330 nm/220～270 nm，對應及類色氨酸類物質(zhì)[22-24]。這2個成分的熒光圖譜及激發(fā)發(fā)射波長載荷見圖7。從圖中可見，2個熒光成分的激發(fā)載荷圖譜具有2個激發(fā)峰和1個發(fā)射峰，主要體現(xiàn)了長波類腐殖質(zhì)及色氨酸物，分析其溶藻過程中，長波類類色氨酸類物質(zhì)增加，為主要溶藻產(chǎn)物。根據(jù)其成分可推測出，藻細胞死亡后，胞內(nèi)的物質(zhì)及細胞組分大量釋放到混合液中。長波類類腐殖酸減少，根據(jù)其化學形成原理(由-COOH、-OH基團的有機化合物合成的結(jié)果)，其中可能含有迫使藻死亡的有效成分，結(jié)合其分子量及極性特征猜測可能為小分子的疏水性氨基酸(hydrophbic acid)。

圖7 PARAPC分析溶藻組分及其激發(fā)發(fā)射波長載荷Fig.7 Fluorescence components identified by the PARAFAC model and their excitation and emission wavelengths

2.5 溶藻活性物質(zhì)的分離與純化

圖8 粗提液的HPLC-200 nm掃描圖Fig.8 HPLC-200 nm scan of crude

溶藻活性物質(zhì)的分離難度大，目前溶藻物質(zhì)的分離純化的報道目前還很少。本研究通過采用高效液相色譜(HPLC)技術(shù)分離提純粗提液，掃描波長200 nm的色譜圖，見圖8。圖中具有多個物質(zhì)峰，可見經(jīng)前處理的菌液成分仍很復雜。每分鐘收集1餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，超純水重溶，并采用24孔板進行溶藻效果檢驗。其中有1餾分具有溶藻效果，見如9，其在既定條件下有個主要峰，保留時間分別為6.005。結(jié)合熒光光譜分析，結(jié)合熒光光譜分析，其屬于某種疏水性酸類。由于HPLC分離效率低，分離量極少而且成本很高，分離的餾分中仍還有其他成分，其溶藻物質(zhì)仍需進一步分離及鑒定。

圖9 溶藻活性物的HPLC-200 nm掃描圖Fig.9 The HPLC-200 nm scan of the lytic active

3 結(jié)論

1)從太湖土著激蕩魚內(nèi)臟中篩選的R1菌(Lysinibacillusmacroides)，以銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)為受試對象，10 d內(nèi)chl-a含量從205.11 mg/L降至35.61 mg/L，溶藻率達82.64%。高溫處置、酸堿處置、透析處置手段確定R1菌通過分泌耐高溫的非蛋白類物質(zhì)溶藻，屬于間接溶藻，且該物質(zhì)具有耐酸耐堿性，其分子量小于500 da。

2)熒光光譜能夠很好的表征銅綠微囊藻含量的變化，其熒光物質(zhì)為藻膽蛋白。溶藻過程中其強度不斷減少，可見藻細胞不斷被破壞，數(shù)量被不斷減少。固定Em為650 nm，通過熒光激發(fā)光譜圖對藻細胞密度進行定量分析。通過熒光光強表征溶藻效果，避免了傳統(tǒng)藻類測量過程的繁瑣，具有重要意義。熒光光譜分析表明溶藻活性物質(zhì)可能為疏水性酸。溶藻過程中，長波類類色氨酸類物質(zhì)增加，為主要溶藻產(chǎn)物。根據(jù)其成分可推測出，藻細胞死亡后，胞內(nèi)的物質(zhì)及細胞組分大量釋放到混合液中。長波類類腐殖酸減少，根據(jù)其成分(含有-COOH、-OH基團的有機化合物)猜測，其中可能含有迫使藻死亡的有效成分，可能為某種疏水性氨基酸(hydrophbic acid)。

3)采用高效液相色譜(HPLC)技術(shù)分離提純粗提液(掃描波長200 nm)，分離結(jié)果表明，從R1粗提液中分離出的1餾分溶藻活性物質(zhì)，其在既定條件下其出峰時間為6～8 min左右，推測其為某種酸類物質(zhì)，但這需要進一步的分離和鑒定。