雷勛明

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopatly，HIE)是指圍生期窒息缺氧導(dǎo)致腦的缺氧缺血性損害(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)而出現(xiàn)的一系列臨床腦病表現(xiàn)，是圍生期足月兒腦損傷的最常見原因，可引起腦性癱瘓、癲癇、智力低下等嚴(yán)重后遺癥[1]。其主要病理改變?yōu)槟X血管梗死及神經(jīng)元凋亡、壞死，腦缺血后，因腦組織缺血缺氧，缺血中心區(qū)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生急性壞死，而在缺血半暗帶區(qū)，神經(jīng)細(xì)胞則發(fā)生以凋亡為主的遲發(fā)性死亡，且凋亡在重新恢復(fù)血流供應(yīng)后不會終止，這與缺血后腦組織損傷面積發(fā)展擴(kuò)大有關(guān)[2]。因此，如何挽救瀕死細(xì)胞、抑制細(xì)胞凋亡以及減少神經(jīng)元死亡是腦缺氧缺血神經(jīng)細(xì)胞損傷后保護(hù)治療重點(diǎn)。人參皂苷Rg1是三七、人參的主要生物活性成分，其具有抗衰老、改善循環(huán)、改善神經(jīng)功能障礙及行為異常、提高機(jī)體免疫力等作用[3]。在成人應(yīng)用心血管疾病治療較多，而在新生兒腦血管疾病中的應(yīng)用報道較少，因此，該實(shí)驗(yàn)通過對新生鼠HIBD模型后注射人參皂苷Rg1，觀察人參皂苷Rg1海馬神經(jīng)元凋亡及對其學(xué)習(xí)能力和記憶力的作用，為臨床新生兒HIE的神經(jīng)功能和認(rèn)知行為障礙的康復(fù)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物 15日齡SD乳鼠60只，體質(zhì)量20～30 g，雌雄不限，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供[實(shí)驗(yàn)動物合格證號SCXK(鄂)2016-0005]，按隨機(jī)數(shù)字表法分為HIBD組、三七皂甙Rg1低劑量組和三七皂甙Rg1高劑量組各20只，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～25 ℃，相對濕度50%，自由飲食進(jìn)水，分籠喂養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 采用改良的Rice-Vannucci法制備HIBD模型[4]，三七皂甙Rg1高、低劑量組結(jié)扎左頸總動脈，HIBD組不結(jié)扎。三七皂甙Rg1低劑量組術(shù)后每天經(jīng)腹腔注射人參皂苷Rg1(10 μg/g)，三七皂甙Rg1高劑量組注射人參皂苷Rg1(20 μg/g)，HIBD組每天一次注射相同劑量的生理鹽水，共25 d。

1.3 記憶力和學(xué)習(xí)能力測試 各組大鼠在注射人參皂苷Rg1或生理鹽水注射25 d結(jié)束后即開始進(jìn)行測試：首先選一個安靜暗室，每天固定在下午5～6點(diǎn)。Y-迷宮為一個三等臂式反射箱，三臂的夾角為120°，底部為可通電的銅棒，每臂端有一信號燈，燈亮表示安全區(qū)，此臂不通電無電流，另兩臂通電(電壓50～70 V，大致固定在能使小鼠產(chǎn)生逃避行為的強(qiáng)度)。實(shí)驗(yàn)時，隨機(jī)變換安全區(qū)，電擊小鼠，以小鼠立即逃往安全區(qū)為一次正確反應(yīng)。具體方法：每只小鼠先在迷宮中適應(yīng)3 min，每次電擊延遲為5 s，直到小鼠的訓(xùn)練過程中連續(xù)9次正確反應(yīng)即為學(xué)會。記錄小鼠學(xué)會所需的訓(xùn)練次數(shù)，訓(xùn)練次數(shù)越少學(xué)習(xí)能力越好[5]。24 h后進(jìn)行記憶保持能力的檢測，以正確反應(yīng)次數(shù)占總檢測次數(shù)的百分比表示記憶保持能力(正確反應(yīng)的次數(shù)/總檢測次數(shù)×100%)。

1.4 海馬神經(jīng)元凋亡情況 采用TUNEL法檢測實(shí)驗(yàn)鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡情況[6]。在學(xué)習(xí)記憶力測試完成后，各組隨機(jī)抽取5只實(shí)驗(yàn)鼠，分離雙側(cè)海馬CA1區(qū)組織；常規(guī)電鏡樣品制備，TUNEL法觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡情況，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作；400倍顯微鏡下，每張切片任意選擇5個視野進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)TUNEL陽性細(xì)胞總數(shù)，以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃染色顆粒為TUNEL陽性細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 各組實(shí)驗(yàn)鼠學(xué)習(xí)能力及記憶力測試正確反應(yīng)率比較 見表1。

表1 各組實(shí)驗(yàn)鼠學(xué)習(xí)能力及記憶力測試正確反應(yīng)率比較

注：與HIBD組比較，aP<0.05；與人參皂苷Rg1低劑量組比較，bP<0.05。

表1結(jié)果表明，HIBD組學(xué)習(xí)能力及記憶力測試正確反應(yīng)率均低于人參皂苷Rg1低劑量組和高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；人參皂苷Rg1低劑量組學(xué)習(xí)能力及記憶力測試正確反應(yīng)率低于高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 各組實(shí)驗(yàn)鼠海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)比較 見表2。

表2 各組實(shí)驗(yàn)鼠海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)比較個)

注：與HIBD組比較，aP<0.05；與人參皂苷Rg1低劑量組比較，bP<0.05。

表2結(jié)果表明，HIBD組海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)高于人參皂苷Rg1低劑量組和高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；人參皂苷Rg1低劑量組海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)高于高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

三七中含有多種皂苷，三七總皂苷是臨床中成人心血管疾病應(yīng)用較多的成分，具有抗氧化、抗衰老、減輕神經(jīng)功能損傷的作用。研究表明，三七總皂苷能抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性氧產(chǎn)生[7]，上調(diào)缺血腦組織的神經(jīng)元特異性烯醇化酶表達(dá)[8]。三七總皂苷可抑制受體中一氧化氮的過量產(chǎn)生，減輕缺氧缺血后的神經(jīng)功能障礙，增加海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞存活數(shù)，對腦缺氧缺血神經(jīng)元起到保護(hù)作用[9]。人參皂苷Rg1是三七總皂苷中藥理最為活性的成分。本研究結(jié)果顯示，HIBD組海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)高于人參皂苷Rg1高、低劑量組，人參皂苷Rg1低劑量組海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)高于高劑量組，表明人參皂苷Rg1能減少新生鼠海馬神經(jīng)元凋亡，大劑量應(yīng)用效果較好。有研究認(rèn)為人參皂苷Rg1抗神經(jīng)凋亡具體機(jī)制涉及MAPK通路[10-11]。

海馬及其周圍皮質(zhì)是神經(jīng)記憶通路的重要組成部分，海馬錐體細(xì)胞層神經(jīng)元的凋亡可能會導(dǎo)致嚴(yán)重的學(xué)習(xí)記憶障礙[12]。有報道電刺激、高壓氧治療可減少梗死灶及其周圍的白細(xì)胞浸潤，使氧自由基的產(chǎn)生減少，避免缺血后細(xì)胞的死亡，通過神經(jīng)源性神經(jīng)保護(hù)作用減輕腦損傷和促進(jìn)腦功能恢復(fù)，提高其學(xué)習(xí)記憶能力[13]。本研究HIBD組學(xué)習(xí)能力及記憶力測試正確反應(yīng)率均低于人參皂苷Rg1高、低劑量組，人參皂苷Rg1低劑量組學(xué)習(xí)能力及記憶力測試正確反應(yīng)率低于高劑量組，表明人參皂苷Rg1能改善HIBD新生鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶力，且與人參皂苷Rg1劑量有關(guān)，大劑量應(yīng)用時效果較好。其機(jī)制與海馬神經(jīng)元內(nèi)多巴胺、腎上腺素和5-羥色胺濃度以及腦內(nèi)M受體濃度有關(guān)，這些神經(jīng)遞質(zhì)可影響學(xué)習(xí)能力和記憶力[14-15]。

人參皂苷Rg1能減少新生鼠HIBD海馬神經(jīng)元凋亡，有效地改善HIBD新生鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶力。然而，人參皂苷Rg1對HIBD海馬神經(jīng)元凋亡及學(xué)習(xí)、記憶力的影響機(jī)制尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。