劉龍龍，宋關(guān)玲*，牛 強(qiáng)，馬儒林，丁玉松，萬真真，曾宏梅，林 霖

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000）

納米TiO2具有較好的光催化活性、抗菌能力強(qiáng)等優(yōu)點，因而廣泛應(yīng)用于電子產(chǎn)品、造紙、護(hù)膚品、食品和醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域[1-3]。然而這些便利的應(yīng)用也伴隨著人們對其對生物安全性的擔(dān)憂。納米TiO2可以通過皮膚、呼吸道以及消化道等途徑進(jìn)入體內(nèi)，并在肝臟、腎臟以及脾臟等器官中蓄積，進(jìn)而使組織產(chǎn)生氧化損傷、炎癥反應(yīng)等[4]。近年來，對納米TiO2的毒性研究主要集中在急性毒性效應(yīng)和長期毒性效應(yīng)層面[5-8]，對其亞急性毒性方面的研究鮮有報道。為此我們以雄性小鼠腎臟為靶器官，初步探究納米TiO2對雄性小鼠腎臟的亞急性毒性效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

主要儀器設(shè)備有酶標(biāo)儀（美國 Bio-Rad公司），手動玻璃勻漿器（上海生物工程公司），高速冷凍離心機(jī)（上海安亭化學(xué)儀器廠）。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-PX)、丙二醛(MDA)、尿酸（UA）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）和蛋白定量試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。銳鈦型納米TiO2（5-10 nm）購自上海晶純生化科技股份有限公司。

1.2 實驗動物分組及染毒方法

SPF級雄性ICR小鼠購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，許可證號：SCXK（新）2011-0003，小鼠 4-5周齡，體重 22～25 g。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫（25±3）℃，相對濕度50%±10%，動物自由飲水?dāng)z食，適應(yīng)飼養(yǎng)一周。將小鼠隨機(jī)分為4組，每組15只，納米TiO2以PBS為輔劑制備懸液，超聲分散30 min后使用渦旋振蕩器充分混勻，以10、50和100 mg/kg BW劑量進(jìn)行連續(xù)灌胃染毒30 d，對照組僅給予PBS。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 腎臟臟器系數(shù)的測定

染毒結(jié)束后，處死雄鼠，快速分離腎臟，稱量并計算臟器系數(shù)［小鼠腎臟系數(shù)=腎臟重量（g）/小鼠體重（g）×1000‰］。

1.3.2 腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)測定

準(zhǔn)確稱量待測腎臟重量，按照重量（g）:體積（mL）=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水，冰浴條件下機(jī)械勻漿，2000 r/min，離心10 min。取上清測定SOD、GSH-PX、MDA指標(biāo)。測定嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3.3 腎功能指標(biāo)測定

組織勻漿制備方法同1.3.2。取上清對Cr、BUN、UA含量進(jìn)行測定，測定嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.4 腎臟組織病理學(xué)評估

脫頸處死小鼠后，迅速取出腎臟，將部分組織固定在4%中性甲醛中，蠟塊包埋，切片，經(jīng)過HE染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

圖1 納米TiO2引起的氧化應(yīng)激Fig.1 The oxidative stress induced by Nano-TiO2

運(yùn)用SPSS11.9軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示。多組間比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析。若方差齊，比較每組實驗數(shù)據(jù)和對照組的差異應(yīng)用Dunnet檢驗，反之則用秩和檢驗。P＜0.05表示差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎臟臟器系數(shù)

同對照組相比較，隨著納米TiO2劑量的增加，小鼠腎臟臟器系數(shù)逐漸增加，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表 1）。

表1 納米TiO2對雄性小鼠腎臟系數(shù)的影響 ±STab.1 The effect of nano-TiO2on the kidney coefficient n=15，S

表1 納米TiO2對雄性小鼠腎臟系數(shù)的影響 ±STab.1 The effect of nano-TiO2on the kidney coefficient n=15，S

組別/（mg/kg） 體重/g 腎重/g 腎臟系數(shù)/‰0 43.66±1.40 0.34±0.03 7.27±0.62 10 42.37±4.53 0.31±0.05 7.38±0.88 50 42.97±3.18 0.33±0.02 7.77±0.56 100 42.54±3.08 0.33±0.06 7.88±0.91

2.2 小鼠腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定結(jié)果

與對照組相比，100 mg/kg BW染毒組SOD活性下降明顯，具有顯著性差異（P＜0.01）（圖 1A）；各染毒組GSH-Px活性與對照組相比，差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖 1B），各染毒組 MDA 含量與對照組相比顯著升高（P＜0.01）（圖 1C）。

2.3 小鼠腎功能指標(biāo)的測定結(jié)果

各染毒組小鼠腎組織肌酐（Cr）含量隨著劑量的升高而逐漸降低，10 mg/kg BW 染毒組Cr含量低于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖 2A），當(dāng)染毒劑量升高到50和100 mg/kg BW時，腎臟Cr含量顯著降低（P＜0.01）（圖 2A）。與對照組相比，各染毒組腎臟BUN、UA含量差異均不具統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖 2B，圖 2C）。

圖2 納米TiO2暴露對腎功能指標(biāo)的影響Fig.2 The influence on the index of renal function after Nano-TiO2exposure

2.4 組織病理學(xué)

與對照組小鼠腎臟組織相比，10 mg/kg BW染毒組中，可見少量炎細(xì)胞浸潤；50 mg/kg BW染毒組，觀察到炎細(xì)胞浸潤，間質(zhì)充血以及腎小管之間的間隙變寬；100 mg/kg BW染毒組觀察到間質(zhì)纖維素樣壞死、腎小球萎縮、腎小管官腔間隙增大以及部分腎小管細(xì)胞脂肪空泡。黃色圓圈表示炎細(xì)胞浸潤，紅色圓圈表示間質(zhì)充血，黑色圓圈表示組織纖維化，綠色箭頭表示細(xì)胞壞死，黃色箭頭表示脂肪空泡，紅色箭頭表示腎小管管腔間隙增大（圖3）。

圖3 納米TiO2暴露后觀察腎臟的組織病理學(xué)變化（×200）Fig.3 The histopathological changes after the exposure of Nano-TiO2（×200）

3 討論

納米TiO2進(jìn)入體內(nèi)，大部分通過腎臟隨尿液排出體外[9]，腎臟承擔(dān)著較高的負(fù)荷，因此極為有必要針對納米TiO2對腎臟的生物安全性予以評估。然而，目前大多數(shù)研究集中在慢性、亞慢性以及急性毒性研究，對于亞急性毒性階段急需展開充分研究?；谝陨犀F(xiàn)狀，我們研究了亞急性染毒階段納米TiO2對雄性小鼠腎臟的毒性。

目前普遍認(rèn)為，氧化應(yīng)激在納米TiO2引起的毒性效應(yīng)中扮演重要的“角色”，納米TiO2進(jìn)入體內(nèi)主要引起組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激，造成氧化損傷[10-11]。本實驗結(jié)果顯示，隨著染毒劑量的升高，染毒組小鼠腎臟的SOD和GSH-PX活性逐漸降低，100 mg/kg BW染毒組的SOD活性與對照組相比顯著下降；各染毒劑量組的MDA水平較對照組顯著升高。SOD和GSH-PX參與維持機(jī)體的氧化-抗氧化平衡[12-13]，兩種酶的活性減弱，表明機(jī)體清除自由基的能力減弱，進(jìn)而表明腎臟受到自由基的攻擊程度加深。膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化的主要產(chǎn)物是MDA，MDA含量增強(qiáng)表明腎臟組織脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)。體外實驗發(fā)現(xiàn)，納米TiO2染毒處理人體腎臟細(xì)胞（HEK-293），染毒組HEK-293細(xì)胞ROS水平升高，GSH和SOD水平降低，脂質(zhì)過氧化水平升高[14]。體內(nèi)實驗中，對雄性小鼠經(jīng)口灌胃納米TiO2(2.5，5，10 mg/kg BW)6個月，染毒組小鼠腎臟組織MDA含量顯著增加[15]。此外，組織病理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)隨著納米TiO2染毒劑量的增加，腎臟組織出現(xiàn)不同程度的損傷。王燕等[16]的研究中也發(fā)現(xiàn)小鼠肝腎出現(xiàn)組織病理學(xué)變化。這證明在亞急性毒性階段，納米TiO2確實可以引起雄性小鼠腎臟氧化損傷。

當(dāng)腎功能正常時，BUN和Cr可以濾過腎小球進(jìn)入尿液；當(dāng)腎小球濾過率下降時，體內(nèi)BUN和Cr含量下降[17]。本研究中并未發(fā)現(xiàn)BUN和UA有明顯變化，這表明納米TiO2尚未引起腎功能損傷。同時需要指出的是，Cr的含量呈現(xiàn)降低趨勢，對于造成其含量下降的原因有待于進(jìn)一步探索。

綜上所述，我們的研究表明納米TiO2暴露雄性ICR小鼠可引起小鼠腎臟組織的氧化損傷，并且對腎功能產(chǎn)生潛在影響。這提示我們將納米TiO2應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品領(lǐng)域時應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格規(guī)范其添加標(biāo)準(zhǔn)，這些納米TiO2將會與人體直接接觸，其生物安全性不容忽視。此外，從事納米TiO2生產(chǎn)工作中的工人長期暴露在一個納米TiO2濃度較高的環(huán)境中，其承擔(dān)的安全風(fēng)險遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通人員，這需要引起我們的重視。我們的研究為進(jìn)一步研究納米TiO2引起的腎臟毒性機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為安全接觸納米TiO2提供了一定的參考和實驗依據(jù)。同時需要指出的是，納米材料種類多，暴露人群的途徑不單一，暴露時間漫長，這些因素都給人類健康帶來更多的不確定性。因此，對有關(guān)于納米材料生物安全性評價的研究工作的投入刻不容緩。