王颯，王文強(qiáng)，李秋實(shí)，慕曉玲*

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002）

人臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞 (human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)由于其易獲取和免疫原性低備受研究者的關(guān)注，其在器官組織損傷后的修復(fù)和再生方面具有良好的臨床應(yīng)用前景[1]。然而如何保證移植入體內(nèi)的hUC-MSCs向受損組織定向遷移仍是其在臨床廣泛應(yīng)用的限制因素。因此對(duì)招募MSCs遷移歸巢到組織損傷部位的調(diào)控機(jī)制研究是促進(jìn)其臨床成功應(yīng)用的重要一步。當(dāng)前認(rèn)為MSCs從循環(huán)系統(tǒng)中向缺血缺氧性損傷、炎性反應(yīng)、機(jī)械損傷、燒傷等組織的遷移主要是損傷部位分泌的趨化因子的招募作用，趨化因子是在炎癥中激活的小分子蛋白，控制著細(xì)胞的招募[2]。白介素-8(interleukin-8，IL-8/CXCL8)是一種細(xì)胞因子，屬于CXC趨化因子家族。在炎性因子刺激下，多種細(xì)胞，包括內(nèi)皮細(xì)胞能夠分泌IL-8。IL-8對(duì)中性粒細(xì)胞?嗜堿性粒細(xì)胞和T細(xì)胞具有強(qiáng)大的趨化作用，與多種炎癥的發(fā)生有關(guān)。而中性粒細(xì)胞是機(jī)體反應(yīng)較早的防御?對(duì)抗組織損傷的白細(xì)胞，在損傷或感染組織釋放的趨化因子IL-8的誘導(dǎo)下，中性粒細(xì)胞遷移到損傷組織，IL-8能選擇性地與中性粒細(xì)胞膜表面的IL-8RA和IL-8RB結(jié)合，激活的IL-8受體通過(guò)誘導(dǎo)趨化因子調(diào)節(jié)子表達(dá)，觸發(fā)局部炎癥反應(yīng)[3-4]。

Ringe J等[5-6]第一次證實(shí)，表達(dá)IL-8受體的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向損傷部位募集是由于炎癥反應(yīng)中產(chǎn)生的趨化因子，如 IL-8、IL-12、CCL 等[5-6]趨化所致。另外已有研究表明，靜脈輸注過(guò)表達(dá)IL-8受體(Interleukin-8 RA and/or RB receptors)的內(nèi)皮細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)動(dòng)物頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷的效果引人注目。加載IL-8受體的內(nèi)皮細(xì)胞模擬了中性粒細(xì)胞的行為，與中性粒細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性地和過(guò)表達(dá)IL-8受體的損傷內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，從而抑制了中性粒細(xì)胞引發(fā)的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)了內(nèi)皮的再生和血管修復(fù)[7]。然而IL-8RA/B過(guò)表達(dá)對(duì)MSCs的動(dòng)員、遷移和募集等的影響研究還很少。

本研究以hUC-MSCs為研究對(duì)象，通過(guò)重組腺病毒轉(zhuǎn)染提高h(yuǎn)UC-MSCs細(xì)胞膜上IL-8的特異性受體IL-8RA/B的表達(dá)，觀察其對(duì)MSCs細(xì)胞趨化、增殖、粘附能力的影響，以尋找進(jìn)一步提高h(yuǎn)UCMSCs歸巢能力的條件，從而提高h(yuǎn)UC-MSCs移植的臨床治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

臍帶取自石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科健康的剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦，均經(jīng)產(chǎn)婦知情同意。pAd-IL-8RAGFP、pAd-IL-8RB-GFP和 pAd-Null-GFP腺病毒由美國(guó)阿拉巴馬大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)系教授贈(zèng)送；胎牛血清、DMEM /Low Glucose(Gibco公司)；胰蛋白酶(Solarbio)；IL-8 細(xì)胞因子 (Peprotech 公司)；cck-8 試劑盒(日本同仁)。

1.2 方法

1.2.1 人臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)的分離、培養(yǎng)

將無(wú)菌條件下取得的臍帶放入含有青霉素和鏈霉素的無(wú)菌平衡磷酸鹽溶液(PBS)中，4 h內(nèi)在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室超凈臺(tái)中按照文獻(xiàn)[8]所述的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)的方法，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗，洗去臍帶上殘留的血跡，將臍帶剪成2-3 cm的小段，每段均沿著靜脈腔剪開后剔除靜脈，再剔除2根動(dòng)脈，取出華通氏膠部分，用剪刀反復(fù)剪成約1-2 mm3小塊，均勻接種于100 mm培養(yǎng)皿中，加入10 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于含5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。4～5 d首次換液，以后每4天換液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%融合，用0.25%胰蛋白酶消化傳代細(xì)胞。

1.2.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(hUVECs)的分離、培養(yǎng)

取10 cm長(zhǎng)的臍帶，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗，洗去臍帶外側(cè)及靜脈腔內(nèi)的血跡，靜脈腔內(nèi)加入5 mL 1%的Ⅱ型膠原酶，止血鉗夾閉兩端，用鑷子輕輕揉搓臍帶，10 min后用含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化并沖臍靜脈，收集細(xì)胞懸液，離心后用ECM 培養(yǎng)基重懸，加入培養(yǎng)皿中，置于含5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后換液，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%融合，用0.25%胰蛋白酶消化傳代細(xì)胞。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物

取擴(kuò)增傳代至第3代的臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，PBS緩沖液輕洗3遍，用0.25%胰蛋白酶消化，血清終止消化后用PBS緩沖液洗滌重懸，調(diào)整為細(xì)胞濃度為 1×106/mL的單細(xì)胞懸液，取0.5 mL/管，共5管，分別加入鼠抗人單克隆抗體FITC-CD29、FITC-CD44、FITC-CD34、FITC-HLA-DR各20 mL，充分混勻，避光，4℃冰箱孵育30 min，每管加入2 mLPBS緩沖液，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 重組腺病毒轉(zhuǎn)染hUC-MSCs

將 P3代hUC-MSCs細(xì)胞按50%～60%接種于DMEM 培養(yǎng)基(含10%FBS)中，將重組腺病毒pAd-IL-8RA-GFP/pAd-IL-8RB-GFP和 pAd-Null-GFP按照MOI=10，30，100，300 感染 hUC-MSCs，48 h 后用熒光顯微鏡觀察 GFP表達(dá)情況以檢測(cè)感染率。

1.2.5 CCK-8試劑盒檢測(cè)腺病毒轉(zhuǎn)染對(duì)hUC-MSCs增殖能力的影響

hUC-MSCs在腺病毒感染48 h后，消化離心重懸，將細(xì)胞按照4×103/孔接種于96孔板中，只加培養(yǎng)基為空白對(duì)照組，每組設(shè)四個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞貼壁后0、24、36、48、72 h 分別加入 10 μL 的 CCK-8 試劑，2 h后用全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀于 460 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量每孔的OD值，以細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制增殖曲線。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-8RA/B對(duì)hUC-MSCs遷移能力的影響

按上述分組對(duì)各組 hUC-MSCs細(xì)胞感染病毒48 h后，調(diào)整細(xì)胞為 106個(gè) /mL，接種至 Transwell小室中 (孔徑為 8 μm)，每上室加入100 μL細(xì)胞懸液，下室中加入600 μL含有100 ng/ml IL-8細(xì)胞因子的培養(yǎng)基，于 37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h；取出Transwell小室后用棉簽擦拭膜上層細(xì)胞，PBS洗3遍后4%多聚甲醛固定15 min；1%的結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗3遍，100倍鏡下觀察，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野，計(jì)算染色細(xì)胞總數(shù)。

1.2.7 粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-8RA/B過(guò)表達(dá)對(duì)hUC-MSCs向體外損傷內(nèi)皮粘附能力的影響

取P3代hUVECs種于24孔板中，待60%～70%密度時(shí)，加入10 ng/mL的TNF-α，培養(yǎng)箱中孵育16 h，分別加入感染48 h的hUC-MSCs細(xì)胞懸液100 μL，培養(yǎng)箱孵育30 min后，PBS緩沖液洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，倒置熒光顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)粘附細(xì)胞數(shù)目[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSCs和hUVECs的分離、傳代及鑒定

原代培養(yǎng)hUC-MSCs 5～7 d，倒置顯微鏡下可觀察到成纖維樣細(xì)胞從臍帶組織塊邊緣爬出，一般14～16 d細(xì)胞可達(dá)到80%～90%融合，連續(xù)傳代至P12代未見(jiàn)到細(xì)胞形態(tài)有明顯改變（圖1）。

圖1 hUC-MSCs的分離、傳代(100×)Fig.1 separation and passage of hUC-MSCs(100×)

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，P3代hUC-MSCs細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)蛋白CD29、CD44，但不表達(dá)造血干細(xì)胞抗原CD34和白細(xì)胞相關(guān)抗原HLA-DR(圖2)。

圖2 流式細(xì)胞儀鑒定hUC-MSCsFig.2 Identification of hUC-MSCs by flow cytometry

原代培養(yǎng)hUVECs 4-5 d，細(xì)胞達(dá)到80%融合，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞成短梭形排列。vWF是內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白，免疫熒光顯示hUVECs表達(dá)vWF幾乎100%，結(jié)果如圖3所示。

圖3 vWF在hUVECs的表達(dá)Fig.3 expression of vWF in hUVECs

2.2 檢測(cè)重組腺病毒轉(zhuǎn)染hUC-MSCs的轉(zhuǎn)染效率

按照不同感染復(fù)數(shù)體外轉(zhuǎn)染hUC-MSCs 48 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MOI=100時(shí)，GFP的表達(dá)達(dá)到80%以上，并且細(xì)胞的狀態(tài)良好，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇此MOI值進(jìn)行轉(zhuǎn)染（圖4）。

圖4 重組腺病毒轉(zhuǎn)染hUC-MSCs后GFP的表達(dá)(100×)Fig.4 expression of GFP on hUC-MSCafter transfection(100×)

2.3 過(guò)表達(dá)IL-8RA/B對(duì)hUC-MSCs增殖能力的影響

CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)測(cè)得轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染hUC-MSCs在 24、36、48、72 h的 OD 值，并作出增殖曲線，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，與未轉(zhuǎn)染的hUC-MSCs相比，過(guò)表達(dá)IL-8RA/B的hUC-MSCs的增殖能力并沒(méi)有明顯差異，P＞0.05（圖 5）。

圖5 腺病毒轉(zhuǎn)染對(duì)hUC-MSCs增殖能力的影響Fig.5 Effect of adenovirus transfection on proliferation of hUC-MSCs

2.4 IL-8RA/B過(guò)表達(dá) 對(duì)hUC-MSCs遷移能力的影響

在IL-8的趨化作用下，觀察到IL-8RA/B過(guò)表達(dá)組穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)目明顯多于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染了空質(zhì)粒組，兩P值均＜0.01，而未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒組并無(wú)明顯區(qū)別（圖6）。

2.5 IL-8RA/B過(guò)表達(dá)對(duì)hUC-MSCs向損傷內(nèi)皮粘附能力的影響(體外實(shí)驗(yàn))

由于TNF-α 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞釋放IL-8因子，粘附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示IL-8RA/B過(guò)表達(dá)組在損傷內(nèi)皮上粘附的細(xì)胞數(shù)目明顯多于空質(zhì)粒組，P＜0.01（圖 7）。

圖6 IL-8RA/B過(guò)表達(dá)對(duì)hUC-MSCs遷移能力的影響Fig.6 Effect of IL-8RA/B on hUC-MSCs cell migration

圖7 IL-8RA/B過(guò)表達(dá)對(duì)hUC-MSCs向損傷內(nèi)皮粘附能力的影響Fig.7 Effect of IL-8RA/B overexpression on adhesion ability to injured endothelial monolayers of hUC-MSCs

3 討論

血管內(nèi)皮是一個(gè)多功能的器官，它在維持血管穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖以及血管生成、防止血栓的形成、介導(dǎo)炎癥與免疫反應(yīng)等方面有著非常重要的作用。血管內(nèi)皮損傷在冠心病、高血壓、糖尿病等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的病理意義[9]。減輕內(nèi)皮損傷、促進(jìn)內(nèi)皮的修復(fù)對(duì)于抑制內(nèi)膜增生有著關(guān)鍵的作用。MSCs是一類低免疫原性能夠在體外誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等的多能干細(xì)胞，可從骨髓、臍帶竇血、臍帶膠樣組織、胎盤、脂肪組織及肺組織等組織中分離，其作為組織工程修復(fù)的種子細(xì)胞受到越來(lái)越多的關(guān)注[10]。有研究表明，循環(huán)中以及周圍組織中的MSCs在各種趨化因子及粘附分子的作用下，可以向損傷部位遷移發(fā)揮其修復(fù)作用，但是在機(jī)體受損的情況下，MSCs很難被動(dòng)員起來(lái)[11-12]。Kim等研究者借助生物材料將MSCs覆蓋在兔子模型頸動(dòng)脈球囊損傷的血管部位，發(fā)現(xiàn)MSCs能夠減輕損傷血管的內(nèi)膜增生情況[13]。因此，移植的MSCs如何能夠有效到達(dá)損傷部位仍是制約其細(xì)胞治療效果的關(guān)鍵。

Rombouts等[14]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)的MSCs的歸巢能力明顯低于原代細(xì)胞，這可能是由于經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)后MSCs表面某些受體的表達(dá)減少。近年來(lái)，關(guān)于SDF-1/CXCR4在MSCs中作用的研究非常多，CXCR4能夠促進(jìn)MSCs在體外向SDF-1遷移[15]，已經(jīng)證明CXCR4過(guò)表達(dá)的MSCs能夠促進(jìn)急性肝損傷的肝再生[16]。因此，通過(guò)基因和細(xì)胞結(jié)合治療疾病已經(jīng)成為現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)。在本研究中，我們給hUC-MSCs加載IL-8RA/B，探討其在體外向IL-8和損傷內(nèi)皮遷移的能力。

IL-8RA/B是趨化因子IL-8的特異性受體，IL-8作為趨化因子家族的一員在很多炎癥疾病中扮演著重要角色[17]，特別是在損傷部位，IL-8分泌增多，并且能夠招募中性粒細(xì)胞，促進(jìn)中性粒細(xì)胞向損傷和炎癥反應(yīng)部位粘附、募集，這主要是由于它和中性粒細(xì)胞表面的IL-8RA/B相互作用[17]。劉等人研究了SDF-1、IL-8、bFGF3種細(xì)胞因子在體外對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的趨化作用，結(jié)果顯示在100 ng/mL時(shí)，SDF-1和IL-8的趨化作用優(yōu)于bFGF，并且二者的作用峰值和趨化的細(xì)胞數(shù)目都比較接近[18]。參照IL-8的濃度，在本研究的Transwell實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)谙率壹尤?00 ng/mL的IL-8因子，結(jié)果表明IL-8能夠明顯促進(jìn)hUC-MSCs向下室遷移，并且過(guò)表達(dá)IL-8RA/B的hUC-MSCs遷移的細(xì)胞數(shù)目明顯多于未轉(zhuǎn)染組。Takashi等人在研究IL-8體外促進(jìn)終末內(nèi)皮細(xì)胞(OEC)的成血管能力時(shí)，對(duì)OEC向IL-8趨化性也做了研究，OEC表達(dá)IL-8RA/B，它能夠向IL-8趨化[19]，這和我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。

另外，本研究中我們觀察到過(guò)表達(dá)IL-8RA/B的hUC-MSCs粘附在TNF-α處理過(guò)的內(nèi)皮細(xì)的數(shù)目更多，也有力地說(shuō)明了IL-8/IL-8RA/B促進(jìn)了MSCs的歸巢。在血管損傷中，受損的內(nèi)皮釋放IL-8，使中性粒細(xì)胞向損傷部位遷移，進(jìn)一步加強(qiáng)炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致內(nèi)膜增生[20]。我們推測(cè)加載了IL-8RA/B的MSCs可能和中性粒細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性向損傷內(nèi)皮粘附，從而減輕炎癥反應(yīng)。

Xing等[7]研究者建立大鼠頸動(dòng)脈損傷模型，通過(guò)股靜脈向大鼠輸注過(guò)表達(dá)IL-8RA/B且表達(dá)GFP的大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，觀察到24 h在損傷部位粘附的過(guò)表達(dá)組細(xì)胞數(shù)目明顯高于空質(zhì)粒組，28 d血管內(nèi)膜增生的情況在過(guò)表達(dá)組得到了很大改善。本研究采用hUC-MSCs，通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染使其過(guò)表達(dá)IL-8RA/B，通過(guò)一系列體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了IL-8受體在hUC-MSCs中表達(dá)，并且IL-8受體的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了其向IL-8因子趨化的能力，這與EC細(xì)胞作為研究對(duì)象的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。鑒于MSCs具有ECs所沒(méi)有的多向分化潛能，以及可以分泌多種因子促進(jìn)損傷修復(fù)的作用，我們推測(cè)過(guò)表達(dá)IL-8受體的hUC-MSCs比內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)血管內(nèi)皮損傷具有更好的效果，這還有待進(jìn)一步探究。