李 敏， 焦 敏， 王長(zhǎng)虹， 李 巖

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011; 2上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所, 上海 201203)

復(fù)方駱駝蓬子軟膏由新疆地產(chǎn)藥材駱駝蓬子、天仙子、秋水仙3味藥材組成，主治關(guān)節(jié)酸痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，具有良好的臨床療效。但復(fù)方駱駝蓬子軟膏在制劑處方工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)上存在問題與缺陷，對(duì)藥品療效的發(fā)揮造成一定影響。孫婷[1]研制出了復(fù)方駱駝蓬子水凝膠貼劑，有效改進(jìn)了其處方工藝上的缺陷。軟膏劑原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有鑒別項(xiàng)，無含量測(cè)定項(xiàng)，制劑中3味藥材的主要有效成分(駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿、鴨嘴花堿、氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品、秋水仙堿)均未檢測(cè)，而現(xiàn)有針對(duì)上述待測(cè)化合物的含量測(cè)定方法均只能檢測(cè)出其中1種或2種物質(zhì)[2-5]。本研究建立了HPLC法同時(shí)檢測(cè)復(fù)方駱駝蓬子凝膠劑和軟膏劑中6種成分的含量測(cè)定方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器Waters 2690-2487型高效液相色譜儀(美國(guó)沃特世公司)，METILER TOLEDO pH計(jì)(梅特勒-托利多公司)，New Classic MF型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市儀器有限公司)，Milli-Q型艾柯超純水儀(美國(guó)密理博公司)。

1.2試藥去氫駱駝蓬堿對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)Z15J7H9148)，秋水仙堿對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)S15A8C34051)，鴨嘴花堿對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)Z05J8S37321)，氫溴酸東莨菪堿對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)Y29J7C18646)，硫酸阿托品對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)M03M7K10353)，駱駝蓬堿對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)Z20J7H9333)，復(fù)方駱駝蓬子水凝膠貼劑(新疆醫(yī)科大學(xué)藥劑實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)20171018-2、20171018-5、20171020-3、20171020-4、20171025-1、20171025-2、20171025-5)，復(fù)方駱駝蓬子軟膏劑(新疆希望制藥有限公司，批號(hào)20171018、20171020、20170721、2017022、20171024、20171025)，冰乙酸(天津市大茂化學(xué)試劑公司，批號(hào)20170801)，甲醇[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司]；乙腈[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司]；甲醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)20171008)，乙酸銨(天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司，批號(hào)20161120)。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 分別稱取鴨嘴花堿2.29 mg、氫溴酸東莨菪堿4.57 mg、硫酸阿托品對(duì)照品3.4 mg、駱駝蓬堿4.50 mg、去氫駱駝蓬堿2.56 mg、秋水仙堿0.46 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.2 供試品溶液 取復(fù)方駱駝蓬子水凝膠貼劑適量，除去防粘紙，將載藥無紡布剪碎并至于具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，密塞，稱重，40℃浸泡提取90 min，放冷，再稱重，甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。取復(fù)方駱駝蓬子軟膏劑適量至于具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL ，密塞，稱重，60℃超聲提取60 min，放冷，再稱重，甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿、氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品、鴨嘴花堿、秋水仙堿HPLC含量測(cè)定色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相：乙腈-乙酸銨緩沖液(3.4 g乙酸銨+0.5 mL冰乙酸+500 mL水，pH值5.32±0.05),梯度洗脫程序：0～7 min時(shí)，乙腈為11%；7～12 min時(shí)，乙腈比例過渡至22%；12～24 min時(shí)，乙腈比例過渡至27%，保持此梯度16 min。檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm和264 nm；柱溫：27 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL。在此條件下，鴨嘴花堿色譜峰相對(duì)保留時(shí)間(tR)為(6.95±0.2)min，東莨菪堿色譜峰tR為(13.3±0.2)min，阿托品色譜峰tR為(15.9±0.2)min，駱駝蓬堿堿色譜峰tR為(18.9±0.2)min，去氫駱駝蓬堿色譜峰tR為(20.36±0.2)min，秋水仙堿色譜峰tR為(25.5±0.2)min。在此條件下，6種待測(cè)物質(zhì)與樣品中其他成分達(dá)到基線分離，見圖1。

圖1 混合對(duì)照品(a)、凝膠劑供試品(b)、軟膏劑供試品(c)、空白對(duì)照(d)的HPLC圖

2.3回歸方程的建立量取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇溶液按照逐步稀釋法，將對(duì)照品儲(chǔ)備液配制成系列梯度溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣量10 μL，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表1。

2.4精密度試驗(yàn)移取復(fù)方駱駝蓬子水凝膠劑的同批供試品溶液適量，于1 d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液10 μL注入色譜儀，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定并記錄色譜圖，經(jīng)計(jì)算凝膠劑鴨嘴花堿峰面積RSD為1.0%，氫溴酸東莨菪堿峰面積RSD為1.3%；硫酸阿托品峰面積RSD為0.8%；駱駝蓬堿峰面積RSD為0.3%；去氫駱駝蓬堿峰面積RSD為0.2%；秋水仙堿峰面積RSD為1.0%，表明儀器精密度良好，見表2。

表1 6種待測(cè)成分的線性方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)

表2 凝膠劑6種待測(cè)物精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)吸取同一供試品溶液適量，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別于2、4、6、10、18、24 h進(jìn)樣，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液10 μL注入色譜儀進(jìn)行測(cè)定并記錄色譜圖，經(jīng)計(jì)算凝膠劑鴨嘴花堿峰面積RSD為2.7%，氫溴酸東莨菪堿峰面積RSD為2.4%；硫酸阿托品峰面積RSD為2.7%；駱駝蓬堿峰面積RSD為0.9%；去氫駱駝蓬堿峰面積為RSD為0.8%；秋水仙堿峰面積RSD為2.6%，表明樣品穩(wěn)定性良好，見表3。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)取同一批復(fù)方駱駝蓬子水凝膠劑樣品，按供試品溶液的制備方法制備6份等濃度供試品溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液10 μL注入色譜儀，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定并記錄色譜圖，經(jīng)計(jì)算凝膠劑鴨嘴花堿含量RSD為0.4%，氫溴酸東莨菪堿含量RSD為1.8%；硫酸阿托品含量RSD為0.9%；駱駝蓬堿含量RSD為0.7%；去氫駱駝蓬堿含量RSD為0.6%;秋水仙堿含量RSD為2.3%，表明樣品重復(fù)性良好,見表4。

表3 凝膠劑6種待測(cè)物穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.7加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的凝膠劑樣品(批號(hào)20171025-5)6份，分別加入鴨嘴花堿、氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品、駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿、秋水仙堿對(duì)照品適量,按“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備樣品并分別測(cè)定6種待測(cè)物質(zhì)的含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果鴨嘴花堿的平均回收率為90.63%(RSD=1.7%)，氫溴酸東莨菪堿的平均回收率為93.90%(RSD=1.3%)；硫酸阿托品的平均回收率為97.05%(RSD=2.6%)；駱駝蓬堿的平均回收率為104.13%(RSD=1.6%)；去氫駱駝蓬堿的平均回收率為101.70%(RSD=1.9%)；秋水仙堿的平均回收率為101.26%(RSD=7.1%)，見表5。

表4 凝膠劑6種待測(cè)物重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n=6, mg/g)

2.8樣品含量測(cè)定經(jīng)測(cè)定凝膠樣品中鴨嘴花堿的平均含量為0.28 mg/g，氫溴酸東莨菪堿的平均含量為0.94 mg/g，硫酸阿托品的平均含量為0.99 mg/g，駱駝蓬堿的平均含量為1.14 mg/g，去氫駱駝蓬堿的平均含量為1.48 mg/g，秋水仙堿的平均含量為0.01 mg/g。軟膏樣品中鴨嘴花堿的平均含量為0.51 mg/g，氫溴酸東莨菪堿的含量為0.86 mg/g，硫酸阿托品的含量為0.54 mg/g，駱駝蓬堿的含量為2.34 mg/g，去氫駱駝蓬堿的含量為1.60 mg/g，秋水仙堿的含量為0.28 mg/g。

表5 凝膠劑的加樣回收率測(cè)定(n=6)

3 討論

3.1梯度洗脫方法的確立本研究對(duì)復(fù)方駱駝蓬子水凝膠貼劑的含量測(cè)定方法進(jìn)行全面考察，同時(shí)也考察了該方法對(duì)軟膏劑進(jìn)行含量測(cè)定的適用性，參考制劑中主要待測(cè)化合物的已有高效液相定量方法[6-14]，嘗試采用了乙腈-水系統(tǒng)、乙腈-0.1%甲酸水系統(tǒng)、甲醇-0.5%氨水系統(tǒng)、乙腈-乙酸銨緩沖液系統(tǒng)，通過對(duì)比不同流動(dòng)相系統(tǒng)下各待測(cè)物質(zhì)的峰形及分離度，最終決定選用乙腈-乙酸銨緩沖液系統(tǒng)梯度洗脫。

3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇據(jù)文獻(xiàn)[6-14]報(bào)道,6種待測(cè)化合物的檢測(cè)波長(zhǎng)均不同，篩選不同波長(zhǎng)后最終決定采用雙通道檢測(cè)方法，分別選定264 nm及250 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，其中鴨嘴花堿、氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品、駱駝蓬堿采用264 nm處的吸收進(jìn)行定量，去氫駱駝蓬堿、秋水仙堿采用250 nm處的吸收作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3提取方法的選擇預(yù)試驗(yàn)時(shí)比較了提取溶劑、提取方法及提取時(shí)間對(duì)復(fù)方駱駝蓬子軟膏劑及凝膠劑中各待測(cè)物質(zhì)提取程度的影響，結(jié)果顯示，復(fù)方駱駝蓬子水凝膠劑的最佳提取方法為甲醇作為提取溶劑，40℃浸提90 min；復(fù)方駱駝蓬子軟膏劑的最佳提取方法為甲醇作為提取溶劑， 60℃超聲提取60 min。

3.46種成分含量分析復(fù)方駱駝蓬子水凝膠劑及軟膏劑均由駱駝蓬子、秋水仙及天仙子3味藥材制成， 6種待測(cè)成分的含量由高至低排列為去氫駱駝蓬堿、駱駝蓬堿、硫酸阿托品、氫溴酸東莨菪堿、鴨嘴花堿、秋水仙堿。由于復(fù)方制劑含有諸多輔料、樣品中雜質(zhì)較多、目標(biāo)待測(cè)物質(zhì)極性、最大吸收波長(zhǎng)的差異均較大等原因，原有含量測(cè)定方法的有效成分提取工藝都較為復(fù)雜；前期研究?jī)H對(duì)軟膏劑中藥材比重較大的駱駝蓬子藥材的3種有效成分(駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿、鴨嘴花堿)進(jìn)行了定量研究[3]，未對(duì)其它2種占比較低且具有一定毒性成分的藥材制定系統(tǒng)、完善的含量測(cè)定方法。因此本研究對(duì)原有含量測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化及完善，可同時(shí)測(cè)定制劑中的6種有效成分的含量。

研究結(jié)果表明，6種待測(cè)有效成分在不同批次制劑中含量較為均一，其中含量較低的成分秋水仙堿在各批次間含量差異稍大但其變化在規(guī)定范圍內(nèi)。因此本研究采用HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方駱駝蓬子水凝膠劑6種成分的方法適用于復(fù)方駱駝蓬子水凝膠劑及軟膏劑的含量測(cè)定，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠、可行，有效地提高了復(fù)方駱駝蓬子制劑的質(zhì)量控制水平并為其標(biāo)準(zhǔn)的提升奠定了基礎(chǔ)。