馬苗苗， 胡云輝,2， 王若崢,2

(1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤免疫與放療研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830011； 2新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療中心， 烏魯木齊 830011)

頭頸部腫瘤是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢(shì)。該病好發(fā)于鼻腔、鼻竇、口咽、下咽、口腔、喉、唇部及頸段食管等部位，其中鱗狀細(xì)胞癌為常見的病理類型，約占頭頸部腫瘤的90%[1]。目前，手術(shù)聯(lián)合放化療等綜合性治療仍是主要治療方式，但因頭頸部腫瘤易發(fā)生局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、預(yù)后較差等特點(diǎn)，成為治療過程中的棘手問題。近些年，免疫治療在腫瘤中成為研究熱點(diǎn)，與傳統(tǒng)療法相比，免疫治療具有高特異性、強(qiáng)殺傷能力、毒副反應(yīng)輕等優(yōu)點(diǎn)[2-3]。已知腫瘤抗原能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)特異性免疫反應(yīng)，可為抗腫瘤的治療提供新思路。

在眾多腫瘤抗原中，腫瘤-睪丸抗原(cancer-testis antigen，CTA)越來越多引起研究者的關(guān)注與重視，這類抗原包括人類婆羅雙樹樣(sal-like，SALL)基因、黑色素瘤抗原(melanoma associated antigen，MAGE)基因家族、滑膜肉瘤X斷裂點(diǎn)基因(synovial sarcoma X break point gene，SSX)基因家族等[4-5]。研究表明，SALL4 和 MAGE-A3在睪丸生殖腫瘤、黑色素瘤、肝癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌等眾多腫瘤組織中高表達(dá)，并與患者臨床特征和預(yù)后相關(guān)，但在頭頸部腫瘤中的相關(guān)報(bào)道較少[6-7]。本研究采用 Cultured 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)，將分離出的頭頸部鱗癌患者外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells， PBMCs)進(jìn)行培養(yǎng)，通過特異SALL4和MAGE-A3抗原多肽體外刺激PBMCs中T淋巴細(xì)胞分泌干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)，在單細(xì)胞水平上測(cè)定其數(shù)量和功能。進(jìn)一步比較這兩個(gè)抗原與臨床特征的相關(guān)性，以期為頭頸部腫瘤的免疫治療提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象收集2016年10月-2017年6月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理明確診斷頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的患者共38例。年齡23～82歲，中位年齡 59歲；其中男性30例，女性 8例，包括鼻竇部腫瘤3例，口腔癌8例，下咽癌11例，喉癌16例(表1)。采集患者治療前肘靜脈血10 mL。入組研究患者均簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理診斷頭頸部鱗狀細(xì)胞癌明確；(2)卡氏(KPS)評(píng)分≥70分者；(3)有完整的臨床病例資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重免疫系統(tǒng)疾病、傳染病、慢性感染者；(2)既往接受過放化療、免疫治療者；(3)合并其他惡性腫瘤；(4)KPS<70分者。

1.2主要試劑與儀器ELISPOT試劑盒由英國牛津大學(xué)MRC人類免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；SALL4、MAGE-A3抗原肽由英國牛津大學(xué)MRC人類免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室合成免費(fèi)贈(zèng)送；96孔板(美國Millipore公司)；細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(PBS)、植物血凝素(PHA)、細(xì)胞刺激因子(H10/IL2)(美國Sigma公司)；臺(tái)盼藍(lán)染液、青霉素-鏈霉素溶液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；一抗、二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3試驗(yàn)方法SALL4、MAGE-A3抗原多肽設(shè)2個(gè)反應(yīng)孔，對(duì)應(yīng)肽段分別設(shè)立1個(gè)陽性對(duì)照孔和1個(gè)陰性對(duì)照孔。(1)從外周血中分離出PBMCs，96孔板加入50 μL濃度為10 mg/L的一抗包被，室溫培養(yǎng)2 h；(2)96孔板用PBS洗滌后加入200 μL含胎牛血清的培養(yǎng)液，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h；(3)舍棄培養(yǎng)液，加入制備好的PBMCs 50 μL，同時(shí)分別加入SALL4、MAGE-A3抗原多肽，陽性對(duì)照加入2 μL的PHA ，陰性對(duì)照孔加入50 μL培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng);(4)2～3 d更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)3 d和10 d時(shí)加入H10/IL2；(5)第13 天棄去培養(yǎng)液，加入一抗50 μL，室溫放置2 h；(6)PBS洗滌后加入二抗，室溫放置1 h；(7)棄去二抗，PBS洗滌后加入10 mL顯色液，室溫放置15 min；(8)再次洗滌，室溫下晾干，讀取數(shù)據(jù)。

表1 38例頭頸部腫瘤患者的基本臨床特征/例(%)

1.4試驗(yàn)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)的96孔板的每一個(gè)斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)抗原多肽激活的一個(gè)分泌 IFN-γ的CTL，記錄的斑點(diǎn)數(shù)對(duì)應(yīng)抗原多肽激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte, CTL)的數(shù)量，斑點(diǎn)形成細(xì)胞(Spots forming cell，SFC)也稱陽性細(xì)胞，采用SFC/106PBMCs表示。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)為試驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)≥3倍的陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)性的比較采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1頭頸部患者中SALL4、MAGE-A3特異性CTL免疫反應(yīng)頻率及強(qiáng)度患者外周血中SALL4、MAGE-A3特異性CTL反應(yīng)頻率分別為47.37%(18/38)和47.37%(18/38)，平均反應(yīng)強(qiáng)度分別為4 233.11 SFC/106PBMCs和2 453.59 SFC/106PBMCs(表2)。

表2 38例頭頸部腫瘤患者SALL4、MAGE-A3特異性CTL反應(yīng)頻率及強(qiáng)度

2.2頭頸部腫瘤患者SALL4特異性CTL反應(yīng)頻率及反應(yīng)強(qiáng)度與臨床特征的關(guān)系SALL4 特異性CTL反應(yīng)頻率及強(qiáng)度在年齡、性別、病灶位置、病理分型、N分期、M分期、臨床分期、病例分型之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在腫瘤T分期中，T1與T2～4期患者SALL4特異性CTL反應(yīng)頻率(18.2%與59.3%)和強(qiáng)度(4 599.73 SFC/106PBMCs與3 945.20 SFC/106PBMCs)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.033和P=0.042)(圖1、2)。

圖1 38例頭頸部腫瘤患者SALL4特異性CTL反應(yīng)頻率

圖2 38例頭頸部腫瘤患者SALL4特異性CTL反應(yīng)強(qiáng)度

2.3頭頸部腫瘤患者M(jìn)AGE-A3特異性CTL反應(yīng)頻率及反應(yīng)強(qiáng)度與臨床特征的關(guān)系MAGE-A3 特異性CTL反應(yīng)頻率及強(qiáng)度在年齡、性別、病灶位置、病理分型、N分期、M分期、臨床分期、病例分型之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在腫瘤T分期中，T1與T2～4期患者M(jìn)AGE-A3特異性CTL反應(yīng)強(qiáng)度(1 449.61 SFC/106PBMCs與2 654.38 SFC/106PBMCs)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036)(圖3、4)。

圖3 38例頭頸部腫瘤患者M(jìn)AGE-A3特異性CTL反應(yīng)頻率

圖4 38例頭頸部腫瘤患者M(jìn)AGE-A3特異性CTL反應(yīng)強(qiáng)度

3 討論

在腫瘤抗原中，CTA具有較強(qiáng)的免疫原性，它能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答[8]，相關(guān)研究已在黑色素瘤、肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌和頭頸部腫瘤等惡性腫瘤中深入開展。雖然CTA基因在多種組織學(xué)來源的腫瘤組織中都有表達(dá)，但其表達(dá)頻率不盡相同，在同一類型的腫瘤中表達(dá)頻率存在很大差異[4,7]。SALL4和MAGE-A3在頭頸部腫瘤中的研究相繼開展，但少有使用Cultured ELISPOT方法進(jìn)行研究。本課題組既往比較了Cultured ELISPOT與普通ELISPOT方法檢測(cè)頭頸部腫瘤睪丸抗原SALL4、MAGE-A3特異性CTL免疫反應(yīng)情況，Cultured ELISPOT可以引較強(qiáng)免疫反應(yīng)，該方法更有利于CTL檢測(cè)[9]，因此，我們使用該方法，進(jìn)一步分析這兩個(gè)蛋白免疫應(yīng)答水平與患者臨床特征的相關(guān)性。

研究證實(shí)，SALL4是調(diào)控SALL基因家族表達(dá)的主要因子，能通過多個(gè)信號(hào)通路細(xì)胞周期調(diào)控及細(xì)胞凋亡中起重要作用[10]。SALL4在多種腫瘤中具有高敏感性和特異性，所以對(duì)于惡性腫瘤的診斷、評(píng)價(jià)預(yù)后和治療中有很大應(yīng)用的價(jià)值[11]。Featherston等[12]通過免疫組化研究了石蠟包埋的頰粘膜鱗狀細(xì)胞癌組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SALL4在巢內(nèi)細(xì)胞上高表達(dá)。Rad等[13]研究者使用定量即時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real time-polymerase chain reaction，qRT-PCR)、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)食管鱗癌組織，發(fā)現(xiàn)SALL4與患者臨床特征、腫瘤高侵襲性及不良預(yù)后有關(guān)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)SALL4的下調(diào)增強(qiáng)了食管鱗癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。國內(nèi)的劉思強(qiáng)等[14]采用PCR和Western blotting方法檢測(cè)50例口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中SALL4表達(dá)情況，結(jié)果顯示癌組織表達(dá)水平高于其在癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另一項(xiàng)在頭頸部喉癌的研究中發(fā)現(xiàn)，SALL4在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率與腫瘤分化程度、臨床分期及局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，表明其可能與喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[15]。

本課題組既往報(bào)道了Cultured ELISPOT方法檢測(cè)頭頸部和食管癌患者外周血中多種CTA特異性CTL免疫反應(yīng)情況，結(jié)果顯示SALL4的反應(yīng)頻率和平均強(qiáng)度分別為76.5%和3 515.47 SFC/106PBMCs，是免疫反應(yīng)最強(qiáng)的指標(biāo)[9]。我們研究通過Cultured ELISPOT方法檢測(cè)頭頸部鱗癌患者外周血中SALL4特異性CTL反應(yīng)頻率和平均強(qiáng)度分別為47.37%(18/38)和4 233.11 SFC/106PBMCs，盡管該方法的判讀較前改進(jìn)，但結(jié)果仍表明患者對(duì)該抗原具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，與既往的報(bào)道一致。與患者的臨床特征相比，在年齡、性別、病灶位置、病理分型、N分期、M分期、臨床分期、病例分型之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腫瘤分期中T1與T2～4期患者SALL4 特異性CTL反應(yīng)頻率和強(qiáng)度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。既往的研究報(bào)道 SALL4與腫瘤分期相關(guān)，隨著腫瘤逐漸進(jìn)展，SALL4在腫瘤組織的表達(dá)量增加，而出現(xiàn)患者外周血CTL反應(yīng)能力上升，其中具體的機(jī)制如何，還需要深入研究。

MAGE家族最早在黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)，而后研究者對(duì)MAGE-A等分子進(jìn)行深入研究。研究發(fā)現(xiàn)，MAGE-A基因去甲基化和腫瘤的臨床特征、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后相關(guān)，并與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)[16]。國外的研究者通過 RT-PCR分析了頭頸部鱗癌中MAGE-A3的表達(dá)情況，結(jié)果表明在腫瘤組織中高表達(dá)[17]。另有研究納入453例頭頸部鱗癌患者，通過免疫組化檢測(cè) MAGE-A3的表達(dá)情況，結(jié)果顯示MAGE-A3蛋白的表達(dá)與患者預(yù)后差相關(guān)[18]。另一項(xiàng)研究，同樣使用免疫組化檢測(cè)頭頸部腺樣囊性癌患者組織中MAGE-A3的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MAGE-A3高表達(dá)患者預(yù)后較差[19]。國內(nèi)的研究者發(fā)現(xiàn)MAGE-A3是喉癌相關(guān)性抗原，與臨床分期、腫瘤大小和淋巴轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，MAGE-A3陽性的患者的總生存期比陰性患者者低。進(jìn)一步通過甲基化檢測(cè)了106例喉鱗狀細(xì)胞癌和22例癌旁組織MAGE-A3甲基化水平，結(jié)果顯示該基因可能成為喉鱗狀細(xì)胞癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記，作為監(jiān)測(cè)患者預(yù)后的重要指標(biāo)[20]。

前期董丹寧等[9]研究者使用Cultured ELISPOT方法檢測(cè)頭頸部腫瘤和食管癌26例患者外周血中MAGE-A3特異性CTL反應(yīng)頻率和強(qiáng)度分別為64.7%，2 353.60 SFC/106PBMCs。本研究中MAGE-A3特異性CTL反應(yīng)頻率和平均強(qiáng)度分別為47.37%(18/38)和2 453.59 SFC/106PBMCs，前者的免疫反應(yīng)頻率較高，可能與判讀方法、入組病種不同有關(guān)。進(jìn)一步與患者的臨床特征相比，在腫瘤T分期中，T1與T2～4期患者相比MAGE-A3 特異性CTL反應(yīng)強(qiáng)度低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在其它臨床特征比較中未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其中原因可能是T1期患者樣本量小，MAGE-A3特異性CTL反應(yīng)陽性率低，還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析。

目前，SALL4和MAGE-A3已有多肽疫苗已被嘗試應(yīng)用于以黑素瘤、肝癌和肺癌為主的多種惡性腫瘤的臨床治療中，并取得了初步療效。本研究通過初步了解頭頸部鱗癌患者中SALL4和MAGE-A3抗原多肽特異性免疫反應(yīng)與臨床特征之間的關(guān)系，為可能在頭頸部腫瘤中免疫治療提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。