馮亞寧， 張典剛， 閆 超， 王若崢,

(1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤免疫與放療研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830011； 2新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療中心， 烏魯木齊 830011)

食管癌(esophageal carcinoma，EC)的發(fā)病率位于全球惡性腫瘤的第八位，死亡率則居第六位[1]。該病通常在發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期。治療食管癌的傳統(tǒng)的方法包括手術(shù)和放化療，但療效不佳[2]。隨著腫瘤免疫治療的興起，一些很有潛力的治療模式取得了令人矚目的成就，具有越來越重要的地位，篩選合適的腫瘤抗原靶點(diǎn)是這一研究的關(guān)鍵。腫瘤睪丸抗原(cancer testis antigen，CTA)屬于腫瘤特異性抗原，其表達(dá)于多種腫瘤組織中，但卻在滋養(yǎng)層細(xì)胞、胎盤及睪丸以外的其它正常組織中不表達(dá)[3]。腫瘤睪丸抗原由多個(gè)基因家族及基因組成，如黑色素瘤抗原 (MAGE)家族、紐約食管鱗狀上皮癌抗原1(NY-ESO-1)家族、滑膜肉瘤X斷裂點(diǎn)基因(SSX)家族和婆羅雙樹樣基因 4(SALL4)等[4]。隨著組織及器官逐漸成熟，人類婆羅雙樹樣基因(SALL4)的表達(dá)數(shù)量也逐漸減少，文獻(xiàn)報(bào)道SALL4和MAGE-A1的表達(dá)在多種非生殖細(xì)胞惡性腫瘤中上調(diào)的特點(diǎn)，符合腫瘤免疫治療對于抗原分子表達(dá)的要求[5-8]。基于以上特點(diǎn)，探討SALL4和MAGE-A1在食管鱗癌中的表達(dá)，具有重要臨床價(jià)值。

酶聯(lián)免疫吸附斑點(diǎn)法(ELISPOT)是一種定量測定 T 細(xì)胞活化相關(guān)參數(shù)的方法，該方法的一大特點(diǎn)是靈敏度高。最常用ELISPOT方法檢測干擾素-γ(IFN-γ)，為 CD8+CTL 激活的標(biāo)志物[9]。本研究采用上述方法，使用人工合成的 SALL4和MAGE-A1 抗原多肽，檢測食管鱗癌患者外周血中淋巴細(xì)胞對特異性抗原的免疫應(yīng)答水平及其與臨床特征的相關(guān)性，以期能夠?yàn)槭彻荀[癌的免疫治療提供實(shí)驗(yàn)相關(guān)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象收集食管鱗癌并有明確病理診斷的初治患者51例，于2015年4月-2016 年10月在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療中心接受治療，年齡為40～82歲，中位年齡63歲。其中，男性28例，女性23例。依據(jù)WHO病理分型，低分化鱗癌13例，中分化鱗癌37例，高分化鱗癌1例。依據(jù)第7版食管癌TNM分期，Ⅰ期1例，Ⅱ期13例，Ⅲ期28例，Ⅳ期9例,51例食管鱗癌患者的一般資料見表1。該研究通過本院倫理委員會(huì)，并且所有研究對象均簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理明確診斷并未行放化療的食管鱗癌患者；(2)臨床分期采用 2010第七版 UICC/AJCC 標(biāo)準(zhǔn)分期；(3)卡氏(KPS)評分≥70者。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往接受過放化療、免疫治療、免疫功能受到影響的，合并嚴(yán)重的全身性系統(tǒng)疾病、有任何惡性腫瘤病史者，合并其他類型惡性腫瘤的患者。

表1 51 例食管鱗癌初治患者的基本臨床特征/例(%)

1.2試劑ELISPOT 試劑盒(英國牛津大學(xué) MRC 人類免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室)，SALL4和MAGE-A1 抗原肽由英國牛津大學(xué) MRC 人類免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)，96 孔板(美國 Millipore 公司)，胎牛血清、RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基、人淋巴細(xì)胞分離液、植物血凝素(PHA)、磷酸鹽緩沖液(PBS)和細(xì)胞刺激因子(H10/IL2)均購自美國 Sigma 公司；青鏈霉素和臺盼藍(lán)購自上海生工生物技術(shù)有限公司。

1.3外周血單核細(xì)胞采集在患者治療前，首先采集肘靜脈血標(biāo)本10 mL(EDTA抗凝)，其次采用密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclearcells，PBMC)，隨后使用臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)并將細(xì)胞重懸，進(jìn)行培養(yǎng) ELISPOT 實(shí)驗(yàn)。

1.4ELISPOT實(shí)驗(yàn)板包被在實(shí)驗(yàn)開始的24 h前進(jìn)行：每份血標(biāo)本對應(yīng)設(shè)置6重孔，1個(gè)陰性對照孔，1個(gè)陽性對照孔，每孔加10 mg/L抗體，體積為50 μL/孔，用封板膜密封后置于 4℃ 冰箱過夜；洗滌：第2天用無菌 PBS 溶液洗滌包被好的96孔板6次；封閉：每孔加入含有10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液200 μL ，在 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置1 h；棄封閉液，調(diào)整PBMCs 為4×104/L， 以50 μL/孔的體積加入96孔板，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)30 min，隨后在對應(yīng)的不同的孔中加入50 μL的肽池溶液，陽性對照 PHA 1 μL；于 37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中靜置過夜；在實(shí)驗(yàn)第3天棄反應(yīng)體系，用PBS溶液洗滌每孔，一抗溶液50 μL/孔，加蓋，37℃ 靜置2 h；用PBS溶液洗滌每孔6次，加入二抗，加蓋后室溫下靜置45～60 min；顯色：用PBS溶液洗滌每孔6次，顯色液10 mL/孔，加蓋，室溫靜置15 min；棄顯色液，用去離子水沖洗每孔6次，在室溫下待96孔板晾干；通過 AIDvSpot Reader Spectrum計(jì)數(shù)。

1.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)96孔板上顯示的每一個(gè)斑點(diǎn)，即意味著存在一個(gè)分泌細(xì)胞因子的CTL，稱作斑點(diǎn)形成細(xì)胞(spots forming cell，SFC)，結(jié)果采用 SFC/106PBMCs 表示，即為反應(yīng)強(qiáng)度。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽性對照孔SFC≥25個(gè)/106PBMCs，陰性對照孔 SFC<30個(gè)/106PBMCs，陽性對照孔SFC≥陰性對照孔SFC的3倍。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 17.0軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，對于計(jì)量資料，采用t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行比較，對于不符合正態(tài)性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)，采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料的比較，則采用 Fisher確切概率法或卡方檢驗(yàn)，以P<0.05時(shí)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Graph Pad Prism5.0 軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。

2 結(jié)果

2.1初治食管鱗癌患者SALL4和MAGE-A1特異性CTL免疫反應(yīng)頻率及強(qiáng)度食管鱗癌患者外周血中 SALL4和MAGE-A1 特異性 CTL 反應(yīng)頻率分別為 29.4%(15/51)和 27.5%(14/51)，反應(yīng)強(qiáng)度分別為78.0和55.7 SFC/106PBMCs(圖1、2)。

2.2初治食管鱗癌患者SALL4特異性CTL反應(yīng)頻率及反應(yīng)強(qiáng)度與臨床特征的關(guān)系SALL4 特異性 CTL 反應(yīng)頻率及強(qiáng)度在年齡、病灶位置、病灶長度、T 分期、N 分期、M分期、臨床分期和病例分型之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

2.3初治食管鱗癌患者M(jìn)AGE-A1特異性CTL反應(yīng)頻率及反應(yīng)強(qiáng)度與臨床特征的關(guān)系N0～1組MAGE-A1特異性CTL反應(yīng)頻率為37.5%，明顯高于N2～3 組(10.5%)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.037)，在年齡、病灶位置、病灶長度、T分期、M分期、臨床分期和病理分型之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MAGE-A1特異性CTL反應(yīng)強(qiáng)度在年齡、病灶位置、病灶長度、T分期、N分期、M分期、臨床分期和病理分型之間差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

2.4初治食管鱗癌患者外周血中SALL4與MAGE-A1特異性CTL免疫應(yīng)答相關(guān)性的分析有35例初治食管鱗癌患者外周血中的T細(xì)胞對SALL4和MAGE-A1 2種抗原肽其中之一發(fā)生特異性CTL反應(yīng)，有15例能與2種抗原肽發(fā)生反應(yīng)(表4)。

表2 初治食管鱗癌患者SALL4特異性CTL反應(yīng)頻率及強(qiáng)度比較

表3 初治食管鱗癌患者M(jìn)AGE-A1特異性CTL反應(yīng)頻率及強(qiáng)度比較

表4 初治食管鱗癌患者外周血中SALL4與MAGE-A1特異性CTL反應(yīng)相關(guān)性分析/例

Spearman相關(guān)分析后結(jié)果顯示，食管鱗癌患者外周血中SALL4特異性CTL免疫反應(yīng)頻率與MAGE-A1特異性CTL免疫反應(yīng)頻率呈現(xiàn)弱相關(guān)(r=0.471，P=0.000)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SALL4和MAGE-A1的特異性CTL免疫反應(yīng)強(qiáng)度之間沒有明顯相關(guān)性(r=0.239，P=0.338)。

3 討論

大量的腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen，TAA)逐漸被發(fā)現(xiàn)，其中腫瘤睪丸抗原(CTA)被認(rèn)為最具有前景的腫瘤相關(guān)抗原之一。

SALL4 是果蠅Spalt 基因的同源異型基因家族中的成員之一，在維持胚胎干細(xì)胞的自我更新、多向分化潛能以及器官形成等方面有舉足輕重的作用[10]。在完全分化的細(xì)胞中，SALL4 基因的表達(dá)被沉默或者下調(diào)，而在多種非生殖細(xì)胞惡性腫瘤中，該基因的激活、表達(dá)上調(diào)及其表達(dá)水平常常與疾病的進(jìn)程、治療效果及預(yù)后相關(guān)。SALL4 也是一種癌基因，癌基因若通過突變、轉(zhuǎn)位等機(jī)制被激活，隨后產(chǎn)生的表達(dá)產(chǎn)物可促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生病變，故SALL4 基因與多種惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，在造血系統(tǒng)惡性腫瘤、生殖惡性腫瘤、惡性橫紋肌肉瘤和乳腺癌中，均可檢測到 SALL4 的高表達(dá)[11-14]。本課題組前期應(yīng)用 ELISPOT 法檢測頭頸部腫瘤患者外周血中 NY-ESO-1、SSX2和SALL4 3種 CTA 特異性 CTL 免疫反應(yīng)，其中 SALL4 特異性 CTL 反應(yīng)頻率及反應(yīng)強(qiáng)度最高[15]。本研究應(yīng)用 ELISPOT 方法檢測 51 例食管鱗癌患者外周血中 SALL4 特異性 CTL 反應(yīng)頻率為 29.4%，提示食管鱗癌患者外周血中可檢測到 SALL4 特異性CTL反應(yīng)，與頭頸部腫瘤患者的研究結(jié)果相似[15]。

MAGE家族廣泛表達(dá)于黑素瘤細(xì)胞系以及其他組織學(xué)類型的部分腫瘤細(xì)胞中，但是在睪丸及滋養(yǎng)層細(xì)胞外幾乎在任何正常的成人組織中都沒有被檢測到[8]，MAGE-A1由 HLA分子呈遞，CTL通過識別 MAGE-A1抗原肽，可以特異性地識別并殺傷腫瘤細(xì)胞，因此其在腫瘤特異性免疫治療的研究中備受關(guān)注。Zamuner等[16]采用 RT-PCR 的方法對89例初治的頭頸部鱗癌(HNSCC)組織進(jìn)行了檢測，測得HNSCC中MAGE-A1的陽性率為44.9%。本研究結(jié)果顯示，51例食管鱗癌患者外周血中MAGE-A1特異性CTL反應(yīng)頻率為27.5%，提示食管鱗癌患者外周血中可檢測到 MAGE-A1特異性CTL反應(yīng)。本研究中N0～1組MAGE-A1特異性CTL反應(yīng)頻率明顯高于N2～3 組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.037)，考慮可能與腫瘤進(jìn)展導(dǎo)致MAGE-A1誘導(dǎo)的特異性CTL反應(yīng)降低有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，隨著淋巴結(jié)逐漸轉(zhuǎn)移，腫瘤患者病情逐漸進(jìn)展，患者體內(nèi) T 細(xì)胞功能逐漸喪失，耗竭的 T 細(xì)胞逐漸失去效應(yīng)能力，削弱 T 細(xì)胞對腫瘤的有效控制，使患者的免疫功能低下[17]。

在研究中分析同一患者外周血中，T細(xì)胞對SALL4和MAGE-A1 2種抗原肽的反應(yīng)，有35例至少與二者其中之一發(fā)生特異性CTL反應(yīng)，占總數(shù)的 68.6% (35/51)，有15例同時(shí)與2種抗原發(fā)生反應(yīng)，占總數(shù)的 29.4% (15/51)。文獻(xiàn)顯示，疫苗一般由一個(gè)或多個(gè)腫瘤抗原物質(zhì)和免疫佐劑組成[18]，治療性癌癥疫苗又是腫瘤免疫治療的重要組成部分，單價(jià)的疫苗用于免疫治療存在療效單薄的弱點(diǎn)，這一結(jié)果提示，制備SALL4和MAGE-A1抗原二價(jià)疫苗用于食管鱗癌患者的免疫治療，不僅可能增加食管鱗癌臨床免疫治療的潛在靶點(diǎn)，而且二價(jià)疫苗的制備可能提高免疫效果。本研究還發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌患者 T 細(xì)胞對于 SALL4和MAGE-A1 2種特異性抗原肽的反應(yīng)頻率之間呈現(xiàn)出了弱的正相關(guān)性，提示可能是這兩種腫瘤抗原有著潛在的共同表位，值得深入研究。

本研究使用的ELISPOT法，不僅可檢測特異性抗原活化后分泌細(xì)胞因子(如 INF-γ、TNF-α 等)的單個(gè)效應(yīng)細(xì)胞的頻數(shù)，并可探討外周血中特異性CTL細(xì)胞的數(shù)量和功能，具有較高的特異性和敏感性[9]，本方法靈敏度遠(yuǎn)超細(xì)胞染色或ELISA 法，在研究腫瘤的發(fā)病機(jī)制、篩選能增強(qiáng) T 細(xì)胞免疫的抗腫瘤活性的抗原表位肽以及疫苗的開發(fā)和評價(jià)方面發(fā)揮重要作用。