王曉慧,羅湘軍,曾 燕

(1.邵陽學院 藥學院,湖南 邵陽,422000； 2.邵陽學院 附屬第二醫(yī)院,湖南 邵陽,422000)

甲巰咪唑(thiamazole)能夠抑制甲狀腺激素的合成,是臨床治療甲狀腺功能亢進癥的一線藥物,目前常用制劑是甲巰咪唑片劑。由于甲巰咪唑片劑生物半衰期短,藥物口服劑量大,口服后血藥濃度不平穩(wěn),部分患者會出現粒細胞下降,肝功能異常等嚴重不良反應[1]。近年來,脂質體作為藥物載體系統(tǒng)能減少藥物不良反應和具有良好的治療靶向性、緩釋性,使其得以迅速發(fā)展和廣泛應用[2-3]。本實驗通過以包封率為指標，應用逆向蒸發(fā)-超聲法制備甲巰咪唑脂質體,同時對比考察了脂質體溶液劑和片劑對大鼠血清T3、T4、TSH影響,旨在獲得一種高效低毒的新型制劑，為該藥新劑型開發(fā)及臨床應用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2100C型高效液相色譜儀(日本島津)，旋轉蒸發(fā)器RE-52AA(上海亞榮),Hitachi H-600透射電子顯微鏡(日本日立)。

1.2 試藥

甲巰咪唑對照品(青島捷世康生物科技有限公司);內標為鄰苯二酚(分析純,湖南師范大學);甲醇(色譜純,北京普析科技有限公司);甲巰咪唑片(北京燕京制廠)；大豆磷脂(西安凱新生物科技有限公司);膽固醇(美國Sigma);甲狀腺素放射免疫分析藥盒(北京原子高科股份有限公司);促甲狀腺激素放射免疫分析藥盒(北京原子高科股份有限公司);T3、T4及TSH質控血清(中國藥品生物制品檢定所)。

1.3 動物

Wistar大鼠雌雄各半,體重(200±10)g，由邵陽學院藥學院動物實驗中心提供。

2 方法

2.1 脂質體的制備

處方：磷脂0.20mol,膽固醇0.05mol,分別加入甲巰咪唑(0.08mol、0.04mol、0.02mol、0.01mol)磷酸緩沖鹽溶液至100ml。

取處方量的磷脂、膽固醇加入氯仿40ml使其全部溶解后作為油相,置250ml磨口圓底燒瓶中,另取處方量甲巰咪唑超聲溶解后作為水相。將水相成細流緩慢加入油相中,超聲至形成W/O型乳液。將制得的乳置于35℃恒溫水浴上,旋轉蒸發(fā)除去氯仿得到半固體膠狀物,再向半固體膠狀物中倒入磷酸緩沖鹽溶液至100ml,繼續(xù)超聲至形成乳白色混懸液,微孔濾膜(0.45μm)過濾,得到乳白色的甲巰咪唑脂質體。

2.2 色譜條件

色譜柱：Waters C18柱(319mm×150mm);流動相：甲醇∶水容積比(10∶90);流速：110ml·min-1;檢測波長：266nm;靈敏度：0.2AUFS；紙速：0.25cm·min-1;進樣量：20μl。

2.3 標準曲線的繪制

精密稱取甲巰咪唑對照品及內標適量,分別加甲醇制成0.2mg·ml-1的對照品溶液和0.8mg·ml-1的內標溶液。精密量取對照品溶液0.25ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml,分別置10ml容量瓶中,精密加入內標液5ml,用甲醇稀釋至刻度,搖勻。按上述色譜條件分別進行測定，以對照品與內標的峰面積比值(Y)為縱坐標,甲巰咪唑的濃度(X)為橫坐標,進行線性回歸。

2.4 回收率試驗

按2.3的操作方法,取1.0ml空白于10ml容量瓶中,分別加入制成0.2mg·ml-1的對照品溶液和0.8mg·ml-1的內標溶液,配制低、中、高質量濃度的甲巰咪唑生理鹽水溶液,按照給定的色譜條件,每個濃度重復測定3次,計算回收率均值。

2.5 精密度試驗

按2.3的操作方法，低、中、高質量濃度的甲巰咪唑生理鹽水溶液,按照給定的色譜條件,重復進樣6次,測定甲巰咪唑濃度,計算RSD。

2.6 包封率測定

將5ml甲巰咪唑脂質體樣品懸液于4℃、100000r·min-1條件下離心2h。準確測量上清體積,采用HLP法測定甲巰咪唑含量(即為游離藥物濃度)。包封率計算公式：包封率/%=(1-游離藥物濃度/全藥濃度)×100%。

2.7 粒徑分析

將甲巰咪唑脂質體稀釋至一定濃度后安放于PCS檢測槽中,對脂質體粒徑進行測定。

2.8 透射電鏡觀察

取甲巰咪唑脂質體懸液加入到四氧化鋨磷酸鹽緩沖液中(體積比2∶1,固定30分鐘后，取少量滴于銅網上,3%磷鎢酸鈉溶液負染后,透射電鏡觀察脂質體的形態(tài)。

2.9 血清T3、T4及TSH測定

2.9.1 試驗分組

大鼠隨機分為2組,每組9只：①甲巰咪唑脂質體溶液(A組);②甲巰咪唑片劑(B組)。每組大鼠每日給藥1次,每次給藥劑量為0.2mg·kg-1、0.3mg·kg-1、0.35mg·kg-1(按人有效劑量折算),連續(xù)給藥8周,股動脈取血4ml,分離血清,測定大鼠血清T3、T4及TSH值，共3次。

2.9.2 T3、T4測定(由邵陽學院附屬第二醫(yī)院檢驗科提供)

取試管加血清50μl,加抗體200μl,加抗原200μl,37℃溫育45min,加DP2R分離劑500μl,以4000r·min-1離心20min,測定放射性計數率。

2.9.3 TSH測定(由邵陽學院附屬第二醫(yī)院檢驗科提供)

取抗體包被管加靜脈血清200μl,加標記物125 I2Ab 200μl,混勻,37℃溫育過夜,棄上清液,加1.0ml洗滌液,搖勻,放置2min,棄上清液,重復洗滌1次,測定各包被管放射性計數。

3 結果

3.1 標準曲線的繪制

按2.3色譜條件分別進行測定,色譜圖見圖1。回歸方程為：Y=0.0257X-0.0060，r=0.9998。實驗結果表明,甲巰咪唑濃度在10～80μg·ml-1范圍內,與對照品和內標的峰面積比值呈良好的線性關系。

1 甲巰咪唑脂質體；2 內標圖1 色譜圖Fig.1 Chromatogram

3.2 回收率試驗

按2.4項下測定并計算回收率均值為100.3%(n=69)，RSD為0.55%。

3.3 精密度試驗

按2.5項下計算RSD為0.3%。

3.4 包封率測定

在磷脂、膽固醇和甲巰咪唑摩爾濃度比為25∶6、25∶3、25∶2、25∶1時,分別制備相應的脂質體,測定其包封率，結果見表1。

3.5 粒徑分析

甲巰咪唑脂質體經激光粒度儀測定,結果顯示，顆粒平均粒為150±15nm,多分散系數(PI)小于0.18,見表1,說明粒徑分布均勻。

表1 甲巰咪唑脂質體的考察指標結果
Table 1 Results of the investigation of methimazole liposomes

樣品標號磷脂∶甲巰咪唑/mol包封率/%平均粒/nm多分散系數/PI125∶632.3148.70.12225∶344.6162.30.14325∶275.8156.50.16425∶132.4142.20.15

3.6 透射電鏡觀察

電鏡下觀察甲巰咪唑脂質體形態(tài)成圓球形,且為單層脂質體,分布均勻,見圖2。

圖2 脂質體透射電鏡圖(×30000)Fig.2 The TEM figure of lipidosome

3.7 血清T3、T4及TSH測定結果

甲巰咪唑不同給藥途徑對大鼠血清T3、T4及TSH值的影響,見表2。

組別T3/(mol·L-1)T4/(nmol·L-1)TSH/(mU·L-1)A組0.362±0.12512.016±0.34510.217±0.1111B組0.581±0.12943.147±0.62170.202±0.1052

A組與B組比較,A組對大鼠血清T3、T4有顯著抑制作用,P<0.05;對TSH的影響,兩組間無顯著性差異，P>0.05。

4 討論

脂質體的制備方法多種多樣[4-7]，常用是薄膜分散法,還有逆向蒸發(fā)法、化學梯度法、冷凍干燥法等。本研究采用逆向蒸發(fā)-超聲法在磷脂和甲巰咪唑摩爾濃度比為25∶2時,制備的脂質體,其包封率可以達到82.2%，此法不失為一種有效、快速和經濟的方法。

口服甲巰咪唑脂質體組和片劑組比較，其藥效顯著高于口服片劑組。這可能是由于脂質體作為一種定向藥物載體,屬于靶向給藥系統(tǒng),能使藥物靶向定位于特定的組織,使藥物具有良好的靶向性、選擇性和通透性[8]，從而可減少用藥的總劑量,降低藥物的不良反應。

綜上所述，逆向蒸發(fā)-超聲法制備的甲巰咪唑脂質體具有明顯提高藥物活性、治療效果和降低藥物毒性的作用，值得在臨床上推廣。但脂質體制劑仍然因存在熱穩(wěn)定性差、以及制備成本高等因素的影響而制約其在臨床上的應用[9]。但此次研究結果,為進一步篩選、優(yōu)化流程，從而制備安全、穩(wěn)定、副作用小和高效的甲巰咪唑脂質體應用制劑提高了有效的方法。